中性粒细胞在PRRSV感染猪肺损伤中的作用以及移植猪肺PRRSV感染模型的构建

发布时间：2020-06-02 08:21

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种危害性较大的猪传染病,每年给我国畜牧业造成巨大的经济损失。对病死猪剖检常常可见肺部出现弥漫性间质性肺炎并伴有大量出血点。但是PRRSV感染猪肺损伤的分子机制却尚不清楚。最近的研究表明,在PRRSV感染7天后的炎症期猪的支气管肺泡灌洗液中的中性粒细胞数显著增加。中性粒细胞是重要的先天免疫细胞,在非特异性免疫系统中起着十分关键的作用,但是过多中性粒细胞在肺部的募集可能造成肺损伤。为了探明中性粒细胞在PRRSV感染猪肺中募集的分子机制以及确认病毒感染导致肺损伤的生物标记物,本研究一部分工作收集了一批人工攻毒的猪肺以及临床自然感染的猪肺,并对一些与中性粒细胞浸润相关的分子以及髓过氧化物酶(MPO)的活性进行了检测。这部分工作对探索PRRSV感染是如何导致肺损伤具有重要意义。但是,由于猪等大型动物不易像小鼠一样进行单个基因的敲除,也不适用于小批量生物试剂的干扰应用,比如使用抗体或者siRNA来中和或者耗竭掉某个细胞因子或蛋白,所以无法更深入的研究PRRSV感染的分子机理。因此第二部分工作主要是在免疫缺陷小鼠上构建移植猪肺的PRRSV感染模型,这部分工作将对后续进一步深入研究PRRSV感染导致肺损伤的分子机理提供重要的实验基础。具体研究结果如下:1.中性粒细胞在PRRSV感染猪肺中募集首先,PRRSV感染显著激活炎症因子的mRNA表达;苏木精伊红(HE)染色发现无论是人工攻毒还是自然感染样本都存在着显著的间质性肺炎、肺泡隔增厚并伴随着大量炎性细胞的浸润等组织病变,diff-quik染色以及免疫组化的方法证实在这些炎性细胞中有大量的中性粒细胞,并且通过荧光定量PCR(qPCR)以及酶联免疫吸附(ELISA)或免疫印迹(Western blot)的方法检测发现,中性粒细胞释放的标志性酶类MPO以及其趋化因子IL-8的mRNA和蛋白表达显著上调;与中性粒细胞跨内皮细胞迁移相关的黏附因子VCAM-1的蛋白表达显著上调,而ICAM-1的mRNA和蛋白表达在人工攻毒组中微微下调,在自然感染组中显著增加,以上结果表明中性粒细胞在PRRSV感染猪肺中募集。另一方面,调节中性粒细胞分化的IL-23→IL-17A→G-CSF轴的mRNA表达显著上调,说明PRRSV感染促使中性粒细胞源源不断的分化成熟进入血液中,促进炎症反应的发生。2.移植猪肺PRRSV感染模型的构建利用免疫缺陷小鼠,将刚出生仔猪的猪肺移植到小鼠肾包膜下。移植手术过后7天和14天,移植物的面积和体积有显著的增加,HE染色显示移植的肺组织保留了正常猪肺组织的形态和结构,说明移植物在小鼠肾包膜下正常生长。接下来本研究选择了三种方式对移植的猪肺组织进行PRRSV攻毒。感染两周后,无论是腹腔注射组、手术注射组、尾静脉注射组都能够通过qPCR检测到PRRSV,HE染色显示三种攻毒方式猪肺组织结构均发生病理学改变,免疫组化和免疫荧光也检测到显著的PRRSV阳性信号,并且炎症相关因子IL-6以及CXCR3的mRNA表达显著上调,以上结果表明移植猪肺PRRSV感染模型构建成功。最后利用该感染模型在体内注射CXCR3的拮抗剂AMG487发现用药过后PRRSV感染受到了显著的抑制,HE染色显示肺组织形态和结构有了明显的好转,而免疫组化和免疫荧光结果显示几乎没有或者只有少量的PRRSV阳性信号,说明AMG487能够明显抑制PRRSV的感染,减缓猪肺的损伤,以上结果证明该模型可以用来筛选和验证治疗PRRSV感染的药物。综上,本研究结果表明,PRRSV感染后显著激活炎症因子的表达,组织学试验和MPO活性试验证实了中性粒细胞在PRRSV感染猪肺中募集,VCAM-1和IL-8的联合表达可以作为病毒感染诱导肺损伤的潜在生物标记物,而中性粒细胞过度募集导致的炎症反应是PRRSV感染猪肺损伤的一个重要因素。本研究还创新型的构建了一种免疫缺陷小鼠肾包膜下移植猪肺的模型,并利用该模型成功感染PRRSV,在此基础上药物注射AMG487成功的抑制了PRRSV在移植的猪肺组织中的感染,减缓了肺损伤,证明该模型切实可行用于一些小分子化合物在猪呼吸系统疾病的研究,从而为能够更好的深入到分子致病机理研究猪的呼吸系统疾病开辟了一条新的途径。
【图文】：

肺泡,中性粒细胞,L-选择素,P-选择素

chen 2009)），从而使中性粒细胞变形能力减弱，更易于黏附于血管内皮细erschuk et al 1999；Halbwachs and Lesavre 2012)（图 1-2）。这一过程是一个理过程，是在多种因子的共同介导下完成的，包括：①.捕获/扣押；②.滚附；④.移出(Ley et al 2007；Schmidt et al 2011)四个步骤。首先，在 IL-1、炎症因子的作用下内皮细胞被激活，，位于其胞浆颗粒中的 P-选择素迅速易表面捕获中性粒细胞，随后内皮细胞表面 P-选择素、E-选择素、L-选择素性粒细胞表面的选择素配体 PSGL-1、L-选择素等黏附因子发生相互作用性粒细胞的缓慢滚动和松驰黏附 (Ley 2003；Ware 2006)。接着中性粒细胞子 IL-8 激活，其上的β2-整合素迅速易位到细胞表面，并与内皮细胞表M-1、VCAM-1 发生相互作用形成紧密黏附 (Muller 2011；Nourshargh and)。最后活化的中性粒细胞在黏附因子 ICAM-1、VCAM-1、血小板内皮细子PECAM-1 以及趋化因子IL-8等的共同介导下, 通过旁细胞途径和跨细越内皮细胞层移出到肺间质和肺泡腔内 (Dolinay et al 2012；Kvietys and S；Zen and Parkos 2005)（图 1-3）。

中性粒细胞,肺部

图 1-2 中性粒细胞在肺部的募集（2011，Jochen Grommes）Fig.1-2 Recruitment of neutrophils into the lung图 1-3 中性粒细胞跨内皮细胞迁移Fig.1-3 Neutrophil trans-endothelial migration
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.28

【参考文献】