影响鸡肌内脂肪沉积相关miRNA的筛选与鉴定

发布时间：2020-06-02 21:41

【摘要】：目的:肌内脂肪(IMF)作为影响肌肉风味的重要物质,其含量对肉质的影响极为显著,是评价肉制品优劣的重要指标。但目前对于鸡胚胎发育早期IMF沉积相关的miRNA及其靶基因的研究较少。本研究以胚胎发育早期的玫瑰冠鸡和科宝鸡腿肌为研究对象,采用高通量测序技术获得与IMF沉积相关的关键miRNA及其靶基因,并研究其涉及的通路及生物学过程,以期探明肌内脂肪(IMF)对肌肉风味调控的分子机理,利用miRNAs靶向干预IMF沉积相关基因,为提高肌肉风味研究提供新思路。方法:(1)采用索氏提取法、高效液相色谱法、试剂盒法分别测定两种鸡肌肉中肌内脂肪、肌苷酸和氨基酸、还原糖和硫胺素的含量;(2)通过对两种鸡肌肉压片的组织学观察,确定两种鸡腿肌和胸肌脂滴开始沉积的时间点;(3)构建两种鸡腿肌的小RNA文库,并通过生物信息学分析方法对测序结果进行分析、用Real-time-qPCR验证库的可靠性;(4)采用miRanda、PITA和RNAhybrid软件预测gga-miR-3532-5p的靶位点,并用双荧光素酶报告基因系统对其与靶基因的靶向关系进行鉴定。结果:(1)玫瑰冠鸡的总氨基酸、必需氨基酸总量、鲜味氨基酸总量均高于科宝鸡(P0.05);玫瑰冠鸡的肌苷酸(IMP)和矫正肌苷酸(IMPc)含量均高于科宝鸡;玫瑰冠鸡的硫胺素、还原糖含量高于或者持平于科宝鸡;玫瑰冠鸡的肌内脂肪(IMF)含量大部分高于科宝鸡;总体来说,玫瑰冠鸡肉品质风味较科宝鸡更优。两种鸡母鸡的五种风味物质含量部分高于公鸡。两种鸡肌肉IMF含量随着日龄的增长部分呈上升趋势。(2)两种鸡腿肌均在胚胎发育第7天开始有脂滴沉积,胸肌均在胚胎发育第8天开始有脂滴沉积,腿肌发育早于胸肌;肌肉中脂滴沉积随胚龄增加呈波浪状‖变化趋势;玫瑰冠鸡脂滴沉积量大于科宝鸡,但沉积速率低于科宝鸡。(3)miRNA测序结果发现:玫瑰冠公鸡的腿肌vs科宝公鸡的腿肌(MGT vs KGT)库共得到差异表达显著的miRNAs 306个(其中154个上调、152个下调),包括已知miRNAs 273个,新预测miRNAs 33个;玫瑰冠母鸡的腿肌vs科宝母鸡的腿肌(MMT vs KMT)库共得到差异表达显著的miRNAs 335个(其中171个上调、164个下调),包括已知miRNAs 286个,新预测miRNAs 49个。GO和KEGG通路分析显示,差异表达的miRNA主要涉及胚胎发育过程和PPAR信号通路(PPAR signaling pathway)等肌内脂肪沉积相关的信号通路。对库中6个差异表达显著miRNA的qRT-PCR验证结果与高通量测序结果一致。(4)筛选到与肌内脂肪沉积相关的gga-miR-3532-5p及其靶基因FABP5,通过双荧光素酶报告基因鉴定显示,gga-miR-3532-5p极显著的抑制了FABP5-3’-UTR区的报告基因活性,使荧光素酶活性下调19.2%(P0.01)。说明gga-miR-3532-5p与FABP5基因存在靶向关系,并抑制其表达。结论:(1)玫瑰冠鸡的营养价值及肌肉风味优于科宝鸡,且母鸡均稍优于公鸡。(2)腿肌在胚胎发育第7天开始有脂滴沉积,胸肌在胚胎发育第8天开始有脂滴沉积,胚胎发育第7天可以作为研究脂滴开始沉积的关键点。(3)两种鸡腿肌的miRNA文库构建成功,分析获得了表达差异显著的miRNAs,其中MGT vs KGT库306个,MMT vs KMT库335个。(4)证明了FABP5是gga-miR-3532-5p的靶基因,推测gga-miR-3532-5p可能通过作用于FABP5基因,参与IMF沉积负调控。
【图文】：

腿肌,宝鸡

图 2-1A 两种鸡 E5~E6 期腿肌组织压片染色结果（100×10） Staining results of leg muscle tissue compression of two chickens with E5 to注：K：科宝鸡；M：玫瑰冠鸡；T：腿肌

腿肌,红色,脂肪滴,小滴

图 2-1 B 两种鸡 E7~E8 期腿肌组织压片染色结果（100×10）Staining results of leg muscle tissue compression of two chickens with E7 toK：科宝鸡；M：玫瑰冠鸡；T：腿肌；图中红色箭头标注的红色小滴即为脂肪滴
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S831

【参考文献】