牛病毒性腹泻病毒基因组分析及LDLR敲除对其侵染牛肾细胞的影响

发布时间：2020-06-03 03:14

【摘要】：背景与目的:牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的牛的一种重要疾病。牛病毒性腹泻病毒基因亚型众多,且新的亚型不断的出现,这使得临床防控BVDV更加困难;而BVDV进入细胞利用的受体和引起的免疫反应仍没有研究清楚,故无法研究针对靶点的的抗病毒药物。本研究通过对BVDV基因组序列分析和其侵染机制的研究,可以为防控BVDV提供理论支持,为新型抗BVDV治疗靶点的设计奠定基础。方法:将临床分离的BVDV病毒BJ1201、BJ1305和BJ1308在牛肾上皮(MDBK)细胞上进行大量扩繁,并提取病毒RNA,对病毒RNA进行全基因组测序;利用生物信息学方法测序分析临床分离株全基因组的特点,并与NCBI数据库的BVDV的典型毒株进行比对,深入分析其遗传进化关系。利用BVDV标准株NADL和临床分离株BJ1305分别感染MDBK细胞,于不同时间点分别提取细胞的总RNA和蛋白。并利用poly I:C激活RIG-Ⅰ评价该通路对病毒复制的影响。使用定量Real-time PCR对感染病毒后不同时间的低密度脂蛋白受体(LDLR))、CD46、RIG-Ⅰ、TLR-3/TLR-7、干扰素调控因子3(IRF-3)和IFN-α/β在基因水平上进行定量;并应用Western blot分别检测其LDLR、CD46、RIG-Ⅰ和BVDVE2蛋白水平的变化。为了深入研究LDLR在BVDV侵染MDBK细胞过程中的作用,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将MDBK细胞的LDLR敲除。构建pCRISPR-LDLR-sg5质粒,与pCRISPR-W9和pCAG-Pbase敲除系统共同电转染入MDBK细胞;利用测序和Western blot鉴定LDLR敲除的单克隆细胞;最后利用LDLR-/-的MDBK细胞进行BVDV侵染试验,用免疫荧光和Western blot等方法评价LDLR缺失对BVDV侵染MDBK细胞的影响。结果:分别根据BVDV全基因组、5'-UTR和Npro基因片段所构建的遗传进化树表明三株BVDV临床分离株为BVDV-1d亚型;利用BVDV标准株NADL和临床分离株BJ1305进行试验,结果显示:BVDV标准株和临床分离株24 h可以显著上调MDBK细胞的膜上受体LDLR和CD46的表达,且可以显著激活MDBK细胞的RIG-Ⅰ模式识别受体,抑制TLR-3/TLR-7模式识别受体,显著下调IRF-3转录水平;且polyⅠ:C激活RIG-1后可抑制CPBVDV复制,而对NCP的复制的影响差异不显著;细胞病变型(CP)BVDV NADL可以诱导产生Ⅰ型IFN(IFN-β),而非细胞病变型(NCP)BVDV BJ1305则显著抑制Ⅰ型IFN(IFN-α/IFN-β)的产生,逃避宿主免疫。成功敲除了 MDBK细胞的LDLR,LDLR缺失的MDBK细胞在感染病毒后24 h和36 h检测到微弱的病毒蛋白表达,而野生型细胞在感染后24 h和36 h则有明显的病毒蛋白印迹。结论:临床分离的三株BVDV均属于BVDV-1d亚型。BVDV利用MDBK细胞膜表面受体LDLR、CD46诱导进入细胞,且LDLR是BVDV进入MDBK细胞利用的主要受体:在胞内BVDV可以被RIG-Ⅰ模式识别受体识别,抑制TLR-3/TLR-7模式识别受体;CPBVDV可以诱导产生Ⅰ型IFN,NCP BVDV抑制Ⅰ型IFN的产生而逃避宿主免疫。
【图文】：

图１－１瘟病毒逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓｅｓ逡逑（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ邋ｏｆ邋Ｖｉｒｏｌｏｇｙ邋ａｎｄ邋Ｃｅｌｌ邋Ｂｉｏｌｏｇｙ邋ｉｎ邋Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ邋ｏｆ邋Ｌｉｉｂｅｃｋ）逡逑．１邋ＢＶＤＶ基因组成和编码蛋白逡逑病毒编码的蛋白由病毒的生物型决定：ＣＰ分离株包含蛋白Ｐ８０和Ｐ１２５，然而ＮＣＰ２５蛋白。ＢＶＤＶ的基因组拥有一个巨大的^u放性编码框，能编码由３８９８个氨基酸组成和非结构蛋白，约４３８邋ｋＤ的多聚蛋白。病毒的１１－１２个多聚蛋白己被鉴定，而ＣＰ分个或多种多聚蛋白。多聚蛋白在宿主和病毒蛋白酶共同作用下经过翻译和翻译后过程白：Ｎｐｆ°，Ｃ，Ｅｍｓ，，邋Ｅｌ，Ｅ２，邋ｐ７，邋ＮＳ２－ＮＳ３邋（ＣＰ型则分解为两个蛋白，ＮＣＰ型则不４Ａ，邋ＮＳ４Ｂ，邋ＮＳ５Ａ，和邋ＮＳ５Ｂ１１．５’７１。逡逑Ｎｐｒｃ／Ｐ２０蛋白是０ＲＦ编码的第一个蛋白产物。该蛋白由１６８个氨基酸组Ｓ－ＰＡＧＥ中分析发现其为保守的２０邋ｋＤ。它具有木瓜样蛋白酶活性，在多聚蛋白的Ｃ端子内剪切，首先从新生的多聚蛋白上释放出来。Ｎｐｒｏ继续将多聚蛋白剪切变成其他的非结构蛋白。病毒的木瓜样蛋白酶活性在病毒复制过程中的功能主要体现在，生成Ｃ蛋白，以及特异性的阻断丨ＲＦ３的活性。ＩＲＦ－３，即干扰素调控因子３邋（邋ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ邋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ

中国农业大学博士学位论文逦第一章前言逡逑拟定的邋ＲＮＡ邋依赖的邋ＲＮＡ邋聚合酶（ＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ＲＮＡ邋ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，邋ＲＤＲＰ）活性丨４Ｍ４］。它是邋ＢＶＤＶ逡逑半衰期最短的蛋白，且没有针对该蛋白的特异性血清抗体可被检测到［４－＇逡逑，＇
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.653

【参考文献】

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本文编号：2694201