基于PI3K-AKT-PPARγ信号通路研究抵抗素对RAW264.7细胞脂质蓄积的影响
发布时间：2020-06-03 03:18
【摘要】：目的:抵抗素(Resistin,RETN)是2001年Steppan在研究胰岛素增敏剂(噻唑烷二酮类药物)的作用机制时发现的一种脂肪细胞因子,与肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病相关联。抵抗素除参与机体炎症与免疫反应,具有促炎作用外;还影响机体糖脂代谢,具有促胰岛素抵抗作用。抵抗素可促使单核或巨噬细胞的IκB磷酸化并与NF-κB解离,使NF-κB信号通路激活,释放IL-6、TNFα等炎症细胞因子,引起炎症反应;除此外,抵抗素还可促进巨噬细胞脂质蓄积,但其作用机制不明确。已有研究表明,罗西土碱和薯蓣皂苷元等可通过PI3K/AKT/PPARγ信号通路抑制巨噬细胞LPL表达,进减少细胞脂质蓄积。抵抗素能够激活PI3K/AKT/PPARγ信号通路,发挥促胰岛素抵抗、影响内皮细胞NO生成、抗细胞凋亡等生物学作用,但其能否通过该信号通路影响LPL表达并进而促进巨噬细胞脂质蓄积,尚有待研究证实。因此,基于PI3K/AKT/PPARγ信号通路开展了抵抗素对RAW264.7细胞LPL表达及脂质蓄积的研究。结果与分析:(1)用终浓度为50 ng/mL,100 ng/mL,150 ng/mL,200 ng/mL的抵抗素孵育RAW264.7细胞24h,用qRT-PCR和Western blot方法分别检测LPL的基因和蛋白表达结果,随抵抗素作用浓度的增高(50-200 ng/mL),RAW264.7细胞LPL基因和蛋白表达增加。终浓度为200 ng/mL的抵抗素孵育RAW264.7细胞,检测其LPL在0h,3h,6h,12h,24h,48h的基因和蛋白表达情况,随抵抗素作用时间(24h以内)的增加LPL基因和蛋白表达也增加。上述结果表明,抵抗素具有促进RAW264.7细胞LPL基因和蛋白表达的作用。(2)用终浓度为40μmol/L的PI3K特异性抑制剂(LY294002)孵育RAW264.7细胞1h,加入终浓度为200 ng/mL的抵抗素继续孵育24h,qRT-PCR检测RAW264.7细胞PI3K、Akt、PPARγ、LPL的基因和蛋白表达变化。LY294002孵育后,添加抵抗素孵育RAW264.7细胞的LPL、PI3K、Akt、PPARγ基因和蛋白表达显著下调(P0.01)。结果表明,抵抗素通过激活PI3K促进LPL基因和蛋白的表达。(3)用LPL-siRNA孵育RAW264.7细胞24h,再添加终浓度为50μmol/mL的ox-LDL孵育1h,加入终浓度为200 ng/mL抵抗素孵育24h,检测LPL的基因和蛋白表达变化,并用油红O染色法检测细胞内脂滴蓄积,酶法定量检测TG、TC的含量。LPL-siRNA孵育后,添加抵抗素孵育RAW264.7细胞的LPL基因和蛋白表达显著降低(P0.01),细胞内脂滴蓄积明显减少,细胞内TG、TC含量显著降低(P0.01)。结果表明,LPL是抵抗素促进巨噬细胞脂质蓄积的关键调控因子。结论:(1)抵抗素具有促进RAW264.7细胞LPL基因和蛋白表达的作用,并受作用浓度和作用时间影响。(2)抵抗素具有与PI3K作用活化PI3K/Akt/PPARγ信号通路进而促进RAW264.7细胞LPL基因和蛋白的表达的作用。(3)抵抗素导致RAW264.7细胞的脂质蓄积与抵抗素促进其LPL基因和蛋白的表达增加密切关联。
【图文】：
A 正常状态下的 RAW264.7 细胞（x400） B 分化较严重的 RAW264.7 细胞（x400）图 2-1 倒置显微镜下观察到的 RAW264.7 细胞（A.B）Fig.2-1 The RAW264.7 细胞 cells observed under inverted microscope(A.B)2.3.2 不同浓度抵抗素对 RAW264.7 细胞 LPL 的表达的影响用终浓度的抵抗素（50 ng/mL，100 ng/mL，150 ng/mL，200 ng/mL）孵育 RAW264.7细胞 24h 后，用 qRT-PCR 和 Western Blot 技术分别检测 LPLmRNA 水平及蛋白水平。如图 2-2 可见各浓度抵抗素孵育细胞后，RAW264.7 细胞 LPL 的 mRNA 水平都极显著高于对照组（P＜0.01），100 ng/mL 组 LPL mRNA 水平显著高于 50 ng/mL 组（P＜0.05），150ng/mL 组极显著高于 100 ng/mL 组（P＜0.01），200 ng/mL 组极显著高于 150 ng/mL 组（P＜0.01），在 50-200 ng/mL 浓度时，RAW264.7 细胞 LPL mRNA 水平随抵抗素浓度增加而增加；如图 2-3 可见各浓度抵抗素处理细胞后，，终浓度为 50 ng/mL，100 ng/mL，150
不同浓度抵抗素对巨噬细胞LPLmRNA水平的影响
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.3
【图文】：
A 正常状态下的 RAW264.7 细胞（x400） B 分化较严重的 RAW264.7 细胞（x400）图 2-1 倒置显微镜下观察到的 RAW264.7 细胞（A.B）Fig.2-1 The RAW264.7 细胞 cells observed under inverted microscope(A.B)2.3.2 不同浓度抵抗素对 RAW264.7 细胞 LPL 的表达的影响用终浓度的抵抗素（50 ng/mL，100 ng/mL，150 ng/mL，200 ng/mL）孵育 RAW264.7细胞 24h 后，用 qRT-PCR 和 Western Blot 技术分别检测 LPLmRNA 水平及蛋白水平。如图 2-2 可见各浓度抵抗素孵育细胞后，RAW264.7 细胞 LPL 的 mRNA 水平都极显著高于对照组（P＜0.01），100 ng/mL 组 LPL mRNA 水平显著高于 50 ng/mL 组（P＜0.05），150ng/mL 组极显著高于 100 ng/mL 组（P＜0.01），200 ng/mL 组极显著高于 150 ng/mL 组（P＜0.01），在 50-200 ng/mL 浓度时，RAW264.7 细胞 LPL mRNA 水平随抵抗素浓度增加而增加；如图 2-3 可见各浓度抵抗素处理细胞后，，终浓度为 50 ng/mL，100 ng/mL，150
不同浓度抵抗素对巨噬细胞LPLmRNA水平的影响
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.3
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本文编号：2694205
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