木犀草素逆转T.pyogenes大环内酯类耐药性的作用及机制研究

发布时间：2020-06-03 07:25

【摘要】：化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes,T.pyogenes)是一种能够引起动物化脓性感染的重要致病菌。耐抗生素T.pyogenes引起的感染性疾病疗效下降已逐渐成为临床治疗的难题。MefA和MsrA外排泵是引起该菌对大环内酯类抗生素耐药的主要原因之一,研究外排泵抑制剂(EPI)对消减/逆转该菌耐药性具有重要意义。但目前已知的EPI如利血平等因其毒性大、副作用多等缺点不便应用于临床治疗。因此,研发低毒高效的EPI成为治疗耐药T.pyogenes等细菌引起的感染性疾病的新策略。木犀草素是一种黄酮类化合物,具有抗菌、消炎、抗过敏和抗肿瘤等多种药理活性,随着对木犀草素抗菌活性研究的不断深入,已有研究表明木犀草素具有抑制细菌外排泵、逆转细菌耐药性的作用。本研究通过PCR方法从本课题组前期鉴定的外排泵阳性T.pyogenes中扩增得到mefA和msrA全基因序列,通过生物信息学技术分析扩增得到的mefA和msrA全基因序列与其它菌株中该基因序列的同源性,预测这两种蛋白的结构及细胞定位等信息,根据这些信息分析MefA和MsrA蛋白导致T.pyogenes耐药的可能机制,在此基础上根据预测的蛋白质三级结构通过计算机辅助模拟木犀草素与外排蛋白的分子对接情况。结果显示,mefA全基因序列与NCBI上已收录序列的核苷酸序列同源率为89%~99%,氨基酸序列同源率为74%~97%,MefA蛋白为非分泌性疏水稳定膜整合蛋白,在PDB数据库中没有模拟到与MefA蛋白同源率较高的三级结构;msrA全基因序列与NCBI上已收录序列的核苷酸和氨基酸序列同源率均为99%~100%,MsrA蛋白为非分泌性亲水稳定蛋白,预测得到可靠的MsrA三级结构模型,且木犀草素可以通过氢键作用力结合于MsrA蛋白分子上。采取微量肉汤稀释法测定红霉素、罗红霉素、乙酰螺旋霉素、泰乐菌素、阿奇霉素、替米考星6种大环内酯类抗生素对木犀草素作用前后T.pyogenes的MIC值,比较MIC值的变化,筛选到木犀草素逆转T.pyogenes耐药性的最佳条件为1/2 MIC药物浓度作用T.pyogenes 36 h。结果显示,通过最佳逆转条件作用后,6种大环内酯类抗生素对携带mefA和msrA基因的T.pyogenes的MIC值均不同程度下降,其耐药性被逆转,而不携带外排基因菌株的MIC值未发生改变,提示木犀草素可能是通过抑制细菌对药物的外排作用来逆转T.pyogenes对大环内酯类抗生素的耐药性。利用DNAMAN软件对木犀草素作用前后T.pyogenes的mefA和msrA全基因序列进行比对分析,以检测木犀草素对mefA和msrA基因序列的影响,并应用荧光定量PCR技术检测木犀草素对mefA、msrA基因的mRNA转录水平的影响。结果显示,木犀草素对mefA和msrA基因核苷酸序列无影响;木犀草素能够极显著降低T.pyogenes msrA、mefA外排基因mRNA转录水平,且大多数菌株的mefA和msrA基因mRNA表达水平下降程度与抗生素MIC值呈相同的下降趋势,该结果与EPI利血平的作用结果一致,说明木犀草素可能是通过抑制T.pyogenes mefA和msrA外排基因的转录而影响其耐药性。本文以大环内酯类外排基因mefA和msrA为研究对象,通过预测其编码的外排泵的结构与功能等信息来分析其与T.pyogenes耐药机制的关系,应用计算机辅助模拟木犀草素与蛋白分子的对接情况,从而探讨黄酮类化合物木犀草素的逆转耐药作用及其分子机制,将为抗耐药菌靶标药物的筛选与研发奠定理论基础。
【图文】：

全基因序列,全基因序列,PCR扩增

通过SWISS-MODEL 在线分析软件预测T. pyogenes MefA和MsrA 外排泵的构。用 Procheck 对蛋白模型进行综合评价。1.2.3 计算机辅助模拟木犀草素与化脓隐秘杆菌外排蛋白的分子对接应用分子模拟软件包 Syby 17.3 来生成木犀草素的初始结构，用 triposGasteiger-marsili 电荷优化分子的几何结构。用 AutoDock 4.2 软件对 MsrA 与木犀行了分子对接。应用拉马克（LGA）遗传算法来计算与蛋白质结合的药物分子的象。在对接过程中，最多考虑了化合物的 10 个构象，取结合自由能最低的构象行进一步的分析。1.3 试验结果与分析1.3.1 化脓隐秘杆菌 mefA 和 msrA 全基因序列 PCR 扩增结果以 T. pyogenes 分离株基因组 DNA 为模板，PCR 扩增 T. pyogenes 的 mefA全基因序列，经 1.0%琼脂糖电泳分析，，符合试验要求，结果见图 1-1 和图 1-2。M 2M 1 21

全基因序列,全基因序列,PCR扩增

通过SWISS-MODEL 在线分析软件预测T. pyogenes MefA和MsrA 外排泵的构。用 Procheck 对蛋白模型进行综合评价。1.2.3 计算机辅助模拟木犀草素与化脓隐秘杆菌外排蛋白的分子对接应用分子模拟软件包 Syby 17.3 来生成木犀草素的初始结构，用 triposGasteiger-marsili 电荷优化分子的几何结构。用 AutoDock 4.2 软件对 MsrA 与木犀行了分子对接。应用拉马克（LGA）遗传算法来计算与蛋白质结合的药物分子的象。在对接过程中，最多考虑了化合物的 10 个构象，取结合自由能最低的构象行进一步的分析。1.3 试验结果与分析1.3.1 化脓隐秘杆菌 mefA 和 msrA 全基因序列 PCR 扩增结果以 T. pyogenes 分离株基因组 DNA 为模板，PCR 扩增 T. pyogenes 的 mefA全基因序列，经 1.0%琼脂糖电泳分析，符合试验要求，结果见图 1-1 和图 1-2。M 2M 1 21
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61

【参考文献】