表达鸡传染性喉气管炎病毒不同长度的gB基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力评价

发布时间：2020-06-03 18:50

【摘要】：鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis,ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)所引起的急性呼吸道传染病。该病具有传播快,死亡率高,且能引起产蛋鸡的产蛋率迅速下降等特点,在我国有进一步扩大流行的趋势。目前主要通过细胞或鸡胚传代致弱的弱毒活疫苗来预防本病,但弱毒活疫苗存在毒力返强的风险,有的弱毒活疫苗还能使鸡发病,引起ILT的爆发和流行。因此,急需研制开发出新一代高效安全的疫苗来防控ILT。鸡痘病毒载体具有外源基因容量大,能产生针对外源基因的免疫应答,宿主范围窄,不会向环境中散毒以及能区分自然感染和免疫接种的动物等独特优越性。因此,在本研究中,我们构建了表达ILTV保护性抗原gB全长或部分截短的3种重组鸡痘病毒的转移载体,分别以两种鸡痘病毒(Fowlpox virus,FPV)282E4株和LP株为母本毒株转染获得了 6种重组鸡痘病毒,评价了其免疫效力,为针对ILTV的鸡痘病毒载体疫苗的研制奠定了基础。1.ILTV gB基因的原核表达及多克隆抗体的制备根据GenBank发表的ILTV gB基因全长序列,用DNAStar软件分析其氨基酸序列的亲水性、抗原性和表面可及性,选择了两段主要抗原区域,分别为861bp和972bp,扩增后连接原核表达载体pET-32a(+)进行原核表达,获得大小约为48kDa的gBa蛋白和51kDa的gBb蛋白,这两种蛋白均为包涵体蛋白。纯化蛋白免疫小鼠,获得gBa和gBb多抗血清。Western-blot结果显示这两种血清具有良好的反应性,能检测LMH细胞中繁殖的ILTV,可用为gB蛋白表达检测的抗血清。2.表达ILTV不同长度gB基因的重组鸡痘病毒的构建利用点突变试剂盒,同义突变了 gB基因上两处与FPV转录终止信号序列相吻合的位点。分别将ILTV gB全长基因和两个抗原性强的gB截短基因(gB1:439-1362bp;gB2:439-2094bp)克隆到鸡痘病毒转移载体p12LS中,获得转移载体p12LS-gB、p12LS-gB1和p12LS-gB2,用脂质体法分别转染已感染鸡痘母本病毒wt-FPVLP和wt-FPV282E4的鸡胚成纤维细胞(CEF),利用蓝白斑筛选,获得纯化的6种重组鸡痘病毒rFPVLP-gB,rFPVLP-gB1,rFPVLP-gB2,rFPV282E4-gB,rFPV282E4-gB1 和 rFPV282E4-gB2。PCR 验证目的基因已成功插入鸡痘病毒基因组;间接免疫荧光试验(IFA)和Western-blot试验证实,gB基因在重组鸡痘病毒载体中表达良好。3.表达ILTV不同长度gB基因的重组鸡痘病毒的免疫效力试验80只28日龄SPF鸡随机分成8组,每组10只,于颈部皮下免疫rFPVLP-gB、rFPVLP-gB2、rFPV282E4-gB、rFPV282E4-gB2、wt-FPVLP和 wt-FPV282E4,剂量为 105PFU/只;同时设商品化ILTV重组鸡痘病毒基因工程疫苗对照组,剂量为105PFU/只;PBS对照组,剂量为0.2 mL/只。免疫后21d,用105EID50/只的ILTV的野毒株119株喉头攻毒,观察各疫苗对鸡的免疫保护效果,并采集喉拭子测定排毒情况。结果表明,rFPVLP-gB和rFPV282E4-gB病毒组的保护率均为100%,高于商品化疫苗组的83.3%,而rFPVLP-gB2和rFPV282E4-gB2病毒组的保护率分别为33.3%和16.7%,低于商品化rFPV基因工程疫苗;排毒结果显示所有疫苗组均排毒。综上所述,在构建的6株rFPVs中,ILTV gB全长基因的表达及免疫效果最好,可作为ILTV的疫苗候选株。
【图文】：

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图１－２邋ｐＥＴ３２ａ－ｇＢａ的及１＋Ａ７？ｏ邋Ｉ双酶切鉴定逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65

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本文编号：2695243