田鼠巴贝斯虫体外培养分泌抗原的筛选及功能鉴定
发布时间：2020-06-03 22:42
【摘要】：田鼠巴贝斯虫是一种重要的经硬蜱传播的顶复门红细胞专性寄生虫。多感染小型啮齿类动物,也可感染人。健康人感染田鼠巴贝斯虫后往往无明显临床症状,但是免疫功能丧失的个体(如脾脏摘除患者,艾滋病患者)和免疫力低下的人群可能会引发严重感染,继而引起由呼吸窘迫或贫血引起的肾功能衰竭,严重时导致死亡。田鼠巴贝斯虫在感染宿主时通过裂殖生殖进行无性繁殖,裂殖子裂解后会入侵更多的红细胞从而对宿主循环系统造成损害。在这个过程中,田鼠巴贝斯虫会分泌一些抗原,这些抗原使得虫体可以有效地识别宿主红细胞并对其进行黏附、入侵等一系列行为。因此,筛选出裂殖子时期重要的分泌蛋白对于探究田鼠巴贝斯虫入侵和致病机制具有重要意义。而筛选、鉴定分泌抗原的一个重要前提是虫体的体外培养,本课题从建立田鼠巴贝斯虫的体外培养方法入手,通过质谱分析田鼠巴贝斯虫高丰度分泌抗原,并对其中两个进行功能研究。具体如下:1.田鼠巴贝斯虫体外培养方法的建立本研究首先建立了田鼠巴贝斯虫体外培养的方法。对HL-1培养基与1640培养基进行比较,结果表明二者并无明显差异。但是从换液及对血清要求来说使用1640培养基要求新鲜宿主血清,实验小鼠需求量大,而HL-1可使用商品化胎牛血清,故最终确定使用HL-1培养基。2.田鼠巴贝斯虫分泌抗原的筛选使用无血清体系培养田鼠巴贝斯虫,分别收取不同时间段的培养上清进行蛋白质液相色谱质谱分析(LC-MS/MS),结果一共筛选到40种蛋白,通过生物信息学分析,发现两种表达丰度较高的蛋白SA1与GPI10。此两种蛋白为GPI家族蛋白,具有锚定在虫体表面的特点,故选择GPI10与SA1进行研究。3.田鼠巴贝斯虫SA1与GPI10的功能鉴定首先对SA1与GPI10进行截短表达片段的扩增,构建含GST标签的pGEX-6p-1-SA1与pGEX-6p-1-GPI10原核表达载体,转化入BL21与Transetta大肠杆菌后分别进行表达,分别从上清与包涵体得到了纯化后的SA1与GPI10重组蛋白。Western blot分析表明rSA1与rGPI10可以被田鼠巴贝斯虫的BALB/c鼠阳性血清特异性识别,证明其具有很好的反应原性。随后分别进行了鼠源与兔源多克隆抗体的制备,对这两种基因的天然蛋白存在形式进行鉴定,发现SA1与GPI10既存在于虫体裂解物中,也存在于染虫红细胞裂解物中。间接免疫荧光试验表明SA1在田鼠巴贝斯虫裂殖子时期大量表达,且在虫体膜和胞质内均能检测到SA1的荧光信号,在激光扫描共聚焦显微镜下可观察到SA1被大量分泌至胞外;相比之下GPI10胞质内和整体表达量均偏少,且主要分布在虫体膜表面;SA1与GPI10共定位表明,二者在虫体膜上的荧光具有部分重叠,存在部分共定位。红细胞结合试验表明SA1与GPI10的重组蛋白具有黏附红细胞的能力,并且黏附量与蛋白量成正比,表明二者均为离子型黏附;红细胞花环试验结果表明SA1蛋白在HEK293T细胞内表达后会通过其GPI锚结构定位在细胞表面,并且这些SA1蛋白会黏附住宿主红细胞形成明显的花环。由此推测这两种蛋白可能对虫体入侵红细胞起着十分重要的作用;抗体中和试验结果表明SA1与GPI10的多克隆抗体均能抑制虫体生长,抗体浓度分别在0.24 mg/mL和0.2 mg/mL时与对照组差异极显著。综合以上,本研究成功建立了田鼠巴贝斯虫短期连续体外培养方法,通过质谱及生物信息学筛选出SA1与GPI10两种分泌蛋白,通过间接免疫荧光、红细胞结合试验、花环试验及抗体中和试验对二者进行了功能鉴定,对深入探讨田鼠巴贝斯虫入侵宿主的分子机制及对田鼠巴贝斯虫病的免疫预防研究具有重要意义。
【图文】：
图 1-1 田鼠巴贝斯虫的传播方式(Vannier et al 2015)Fig. 1-1 Transmission of B. microti田鼠巴贝斯虫大多数情况下经丹敏硬蜱传播，极少数情况下会tblade et al 2017)。在美国，田鼠巴贝斯虫的主要保虫宿主（reservoir 足鼠（white-footed mice），人是偶见宿主（incidental hosts）。成年未携带田鼠巴贝斯虫的雌性蜱虫会在春季进行产卵，，此为第一vae）会在第一年夏初孵化，并在夏末从受感染的白足鼠身上吸食血液贝斯虫。此时为田鼠巴贝斯虫的有性生殖阶段，配子体进入幼蜱的肠殖，大小配子体进行融合形成二倍体合子。二倍体合子分裂后产生单倍单倍体合子移动到蜱的唾液腺等其他器官中形成动合子，动合子最终化发育成为子孢子。幼蜱在第二年春天蜕皮从而成长为若蜱（nymph，若蜱叮咬鼠或者人时，其唾液腺中的子孢子会进入动物体内，该阶斯虫无性生殖阶段，子孢子入侵红细胞后会分化成滋养体，而后发育为到一定数量后，红细胞会裂解，虫体释放，再次入侵新的红细胞，如
图 1-2 疟原虫裂殖子 3D 超微结构(Bannister et al 2000)Fig. 1-2 Three-dimensional organization of a Plasmodium falciparum merozoite顶复亚门有包括如疟原虫、弓形虫、隐孢子虫等在内的对公共卫生安全存在严威胁的原生动物。巴贝斯虫作为顶复亚门原虫中的一员，其在亚细胞结构上拥有其他顶复门原虫类似的细胞器，如顶质体、微线体、棒状体及致密颗粒（巴贝斯中为球状体）等(DelCarmenTerronetal2016)，这些相似的生物学结构决定了虫体侵宿主时存在相对保守的机制。在巴贝斯虫领域中牛巴贝斯虫的入侵机制研究最透彻，牛巴贝斯虫在裂殖子时期入侵宿主的红细胞时，首先会对红细胞产生黏附，后进行特异位点识别使得虫体的顶端立即再定位至红细胞膜上，同时虫体会分泌RAP(何军伟 2017)、AMA1、RAP1(张文杰 2012)等抗原定位在虫体表面而后使虫相关蛋白与红细胞表面受体形成紧密连接复合物，介导虫体的入侵。随着虫体进宿主红细胞，红细胞质膜内陷，在虫体四周构成纳虫泡，之后虫体分泌 SBPs 改变细胞内环境，从而内化宿主细胞，使得虫体可以在其中进行增殖(张庆丽 2012)，此完成整个入侵过程(Yokoyama et al 2006)。这五个阶段便成为了目前广为认可的贝斯虫入侵宿主的模式阶段。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.7
本文编号：2695508
【图文】：
图 1-1 田鼠巴贝斯虫的传播方式(Vannier et al 2015)Fig. 1-1 Transmission of B. microti田鼠巴贝斯虫大多数情况下经丹敏硬蜱传播，极少数情况下会tblade et al 2017)。在美国，田鼠巴贝斯虫的主要保虫宿主（reservoir 足鼠（white-footed mice），人是偶见宿主（incidental hosts）。成年未携带田鼠巴贝斯虫的雌性蜱虫会在春季进行产卵，，此为第一vae）会在第一年夏初孵化，并在夏末从受感染的白足鼠身上吸食血液贝斯虫。此时为田鼠巴贝斯虫的有性生殖阶段，配子体进入幼蜱的肠殖，大小配子体进行融合形成二倍体合子。二倍体合子分裂后产生单倍单倍体合子移动到蜱的唾液腺等其他器官中形成动合子，动合子最终化发育成为子孢子。幼蜱在第二年春天蜕皮从而成长为若蜱（nymph，若蜱叮咬鼠或者人时，其唾液腺中的子孢子会进入动物体内，该阶斯虫无性生殖阶段，子孢子入侵红细胞后会分化成滋养体，而后发育为到一定数量后，红细胞会裂解，虫体释放，再次入侵新的红细胞，如
图 1-2 疟原虫裂殖子 3D 超微结构(Bannister et al 2000)Fig. 1-2 Three-dimensional organization of a Plasmodium falciparum merozoite顶复亚门有包括如疟原虫、弓形虫、隐孢子虫等在内的对公共卫生安全存在严威胁的原生动物。巴贝斯虫作为顶复亚门原虫中的一员，其在亚细胞结构上拥有其他顶复门原虫类似的细胞器，如顶质体、微线体、棒状体及致密颗粒（巴贝斯中为球状体）等(DelCarmenTerronetal2016)，这些相似的生物学结构决定了虫体侵宿主时存在相对保守的机制。在巴贝斯虫领域中牛巴贝斯虫的入侵机制研究最透彻，牛巴贝斯虫在裂殖子时期入侵宿主的红细胞时，首先会对红细胞产生黏附，后进行特异位点识别使得虫体的顶端立即再定位至红细胞膜上，同时虫体会分泌RAP(何军伟 2017)、AMA1、RAP1(张文杰 2012)等抗原定位在虫体表面而后使虫相关蛋白与红细胞表面受体形成紧密连接复合物，介导虫体的入侵。随着虫体进宿主红细胞，红细胞质膜内陷，在虫体四周构成纳虫泡，之后虫体分泌 SBPs 改变细胞内环境，从而内化宿主细胞，使得虫体可以在其中进行增殖(张庆丽 2012)，此完成整个入侵过程(Yokoyama et al 2006)。这五个阶段便成为了目前广为认可的贝斯虫入侵宿主的模式阶段。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.7
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 杨万莲,夏兆飞,李伊立;犬巴贝斯虫病的诊治[J];中国兽医杂志;2004年10期
2 赵俊龙,刘钟灵;巴贝斯虫体外培养技术及其应用的研究进展[J];中国兽医寄生虫病;1997年04期
相关硕士学位论文 前3条
1 何军伟;东方巴贝斯虫TRAP2基因的克隆表达及其部分功能研究[D];华中农业大学;2017年
2 张文杰;东方巴贝斯虫棒状体相关蛋白1（RAP1）基因克隆及免疫特性研究[D];华中农业大学;2012年
3 张庆丽;牛红细胞表面受体糖蛋白和东方巴贝斯虫球状体蛋白3基因的克隆表达及分析[D];华中农业大学;2012年
本文编号：2695508
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/2695508.html
