鸡永生化前脂肪细胞系的建立及分析

发布时间：2020-06-04 02:38

【摘要】：鸡是重要的非哺乳类脊椎模式动物,已被广泛用于发育生物学、病毒学和免疫学研究。由于鸡具有天然的高血糖和胰岛素抵抗的特性,使得鸡成为了研究人类肥胖、胰岛素抵抗和二型糖尿病的潜在动物模型。在现代肉鸡产业中,肉鸡的腹脂过度沉积给肉鸡业生产带来了严重的经济和环境问题,已成为一个亟待解决的难题。要解决这个难题,就必需要了解鸡的脂肪组织是如何形成的,即必须了解鸡脂肪细胞的分化及其分子调控机制。目前,鸡的永生化前脂肪细胞系至今尚未建立,导致鸡的脂肪生成机制和肥胖症发病机理研究滞后。本研究的目的是建立永生化的鸡前脂肪细胞系,并揭示鸡脂肪细胞分化过程中的基因表达规律。研究首次利用鸡的端粒酶逆转录酶(chTERT)和鸡的端粒酶RNA(chTR)重建了鸡前脂肪细胞的端粒酶活性,并成功建立了两个永生化的鸡前脂肪细胞系。首先克隆了chTERT和chTR基因,构建了这两个基因的逆转录病毒表达载体pLXRN-chTERT和pLPCX-chTR,分别与pVSV-G共转染GP2-293包装细胞,制备了相应的逆转录病毒。分离培养原代鸡前脂肪细胞,采用单独感染chTERT逆转录病毒和联合感染chTERT、chTR两种逆转录病毒的方法,利用药物筛选获得了两个永生化的鸡前脂肪细胞系,同时证明了鸡前脂肪细胞的端粒酶活性的限速成分是chTERT而不是chTR。研究将单独感染chTERT逆转录病毒的永生化鸡前脂肪细胞系命名为immortalized chicken preadipocyte 1(ICP1),将联合感染chTERT和chTR逆转录病毒的永生化鸡前脂肪细胞系命名为immortalized chicken preadipocyte 2(ICP2)。细胞增殖特性分析结果表明,ICP1和ICP2细胞在体外累积群体倍增数(PDs)均超过了100,达到了永生化细胞的判定标准;细胞形态学和β-gal染色分析结果都表明,ICP1和ICP2保持了原代鸡前脂肪细胞的基本形态,并且没有出现衰老表型;半定量RT-PCR和TRAP分析结果表明,ICP1和ICP2细胞高表达端粒酶基因,且具有极高的端粒酶活性;DNA倍体分析结果表明,ICP1和ICP2细胞是非整倍体;锚定不依赖性生长分析结果表明,ICP1和ICP2细胞没有发生恶性转化;同工酶分析和PCR物种鉴定分析结果表明,ICP1和ICP2细胞是鸡源细胞,并且排除其它细胞污染的可能性;分化特性分析结果表明,ICP1和ICP2细胞保持了原代鸡前脂肪细胞的分化能力,其脂肪细胞分化标记基因的表达模式与原代鸡前脂肪细胞相似。最后,应用Agilent鸡全基因4×44K芯片,分析了鸡前脂肪细胞系在整个分化过程中的基因表达谱,筛选出与鸡脂肪细胞分化相关的差异基因,并进行了基因功能注释和基因通路分析。本研究首次报道了通过单独转导chTERT或联合转导chTERT和chTR能够重建鸡的端粒酶活性,并成功建立了两个永生化的鸡前脂肪细胞系,同时利用细胞系开展了鸡前脂肪细胞分化过程中的基因表达谱分析。所建立的永生化鸡前脂肪细胞系为研究鸡脂肪形成、脂类代谢、肥胖和相关疾病等提供了理想的体外细胞模型,研究结果同时为永生化其它类型的鸟类细胞提供了线索。鸡前脂肪细胞分化过程中的表达谱分析结果为进一步揭示鸡前脂肪细胞分化的分子机制奠定了基础。
【图文】：

基因组序列,端粒序列,图谱,端粒

位于中小染色体上，而与大染色体无关，并且均是在染色体的一端出现巨型端粒，而另一端含有正常大小的端粒。图1-1 鸡染色体的端粒序列图谱[58]Fig.1-1 Telomeric sequence ideogram of chicken chromosomesO'Hare和Delany[75]比较了鸡的正常细胞（来自UCD 001、ADOL Line 0）、永生化细胞（DF-1）和转化细胞（DT40）间的端粒差异。发现来自这4种不同遗传背景材料的细胞中，巨型端粒的数量和分布以及全部端粒序列在基因组中所占比例都存在显著差异。有趣的是，基因组中端粒序列最多的是DF-1（一个非转化的、永生化的、端粒酶阴性的鸡胚胎成纤维细胞系）细胞，占基因组序列的17%，，与之相比，UCD 001鸡占5%，DT40细胞占1.2%。究竟是什么原因导致鸡的端粒序列数量和差异如此之大目前还不清楚，推测这可能与鸡的基因重组形式以及端粒的维持机制有关。巨型端粒的长度和分布在不同种类、不同个体（甚至在鸡高度近交的家系中）、不同基因型的鸟类间是高度可变的[72,74-76]。Rodrigue等[76]的遗传研究显示，在鸡近交系的同胞之间，巨型端粒表现出高度变异和不均一性

基序,蛋白,相对位置,端粒

v-II、v-III、v-IV、1、2、A 、B'、C、D和E，以及端粒特有的“T”基序[99,100]（见图1-2）。chTERT蛋白与人（human TERT, hTERT）和鼠（mouse TERT, mTERT）相比，相似性只有45%和41%，但是chTERT含有所有上述那些基序，它们分别是：v-（I1~196），v-I（I495~531），v-II（I554~588），v-IV（625~753），T基序（756~803）
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S831

【参考文献】