弓形虫致密颗粒蛋白基因缺失株的构建及其生物学特性研究

发布时间：2020-06-04 06:09

【摘要】：弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种宿主广泛的顶复门原虫,不仅给畜牧业生产造成严重经济损失,而且也严重威胁人的生命和健康。致密颗粒(Dense granule,GRA)是顶复门原虫所特有的分泌器官,其分泌的致密颗粒蛋白具有调节信号通路、参与虫体生长、维持纳虫空泡和纳虫空泡膜的稳定性等重要作用。本实验首先利用CRISPR/Cas9介导的非同源性末端接合(NHEJ)技术,对弓形虫Ⅰ型RH虫株的17种GRA基因(GRA11、GRA12 bis、GRA13、GRA14、GRA20、GRA21、GRA28-31、GRA33-38和GRA40)进行敲除,然后观察17种GRA缺失株的逸出能力、体外噬斑形成率和小鼠毒力,发现上述17种GRA基因缺失并不能对虫株逸出能力、体外增殖速度和小鼠毒力产生影响。然后,通过CRISPR/Cas9介导的同源重组(HR)技术,构建了Ⅰ型RH和Π型Pru GRA12缺失虫株及GRA12缺失回补虫株,发现其在体外增殖和虫斑形成率上与野生株并无显著性差异,但在小鼠毒力方面,RHΔGRA12敲除虫株感染小鼠可存活至21天,PruΔGRA12虫株毒力明显减弱,且形成的脑包囊数显著减少,由此可以得出GRA12在Ⅰ型和Π型虫株中是一种毒力基因。根据文献报道,ROP18也可以影响弓形虫对小鼠的毒力作用,因此我们构建了Ⅰ型虫株ROP18基因缺失株,在此基础上进行GRA12基因的敲除,成功构建了RHΔROP18ΔGRA12双缺失虫株,并利用PCR扩增和Western Blot验证ROP18和GRA12基因均被成功敲除。以RHΔROP18ΔGRA12双缺失株感染C57BL/6小鼠,每只小鼠接种100个双缺失株速殖子,结果显示30 d内小鼠未发生死亡,说明双敲除两种基因后弓形虫毒力进一步降低。待小鼠存活45 d后,再次感染RH野生株速殖子100个,小鼠在30 d内均未发生死亡,说明此剂量内的RHΔROP18ΔGRA12虫株,可以对野生株RH的再次感染起到免疫保护作用,能作为一种弱毒疫苗候选虫株。综上所述,本研究共构建了18种GRA基因敲除虫株,阐明了其基本生物学功能,发现17种GRA基因(GRA11、GRA12 bis、GRA13、GRA14、GRA20、GRA21、GRA28-31、GRA33-38和GRA40)缺失不影响弓形虫的逸出、增殖及对小鼠的毒力;其中的GRA12虽然在Ⅰ型和Π型虫株中不影响体外裂殖,但是明显减弱弓形虫的毒力。我们构建了ROP18和GRA12双敲除虫株,发现RHΔROP18ΔGRA12虫株可以显著减弱弓形虫对小鼠的毒力,具有作为一种弱毒疫苗的潜力,为研发抗弓形虫疫苗奠定了基础。
【图文】：

17图 2.2 RNA 水平鉴定阳性单克隆虫株Figure 2.2 Identification of positive monoclonal strains in the RNAlevelMarker：Trans 2000 Plus DNAmarker实验

硕士学位论文 第二章 弓形虫 GRA 基因缺失株筛选后的虫株，进行 25T HFF 细胞扩大培养，提取 DNA 或 RNA用 PCR 验证敲除。结果显示，RH 野生株均可以扩增出大小为 22均未扩增出条带（图 2.1 和图 2.2）。说明 17 种 GRA 敲除虫株均
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.72

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本文编号：2695994