化脓隐秘杆菌溶血素Domain 4单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

发布时间：2020-06-04 15:21

【摘要】：化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes,T.pyogenes)是一种革兰氏阳性、不规则、无运动性及不含孢子结构的短杆菌。它被认为是一种广泛存在于家畜黏膜表面的较为常见的机会性致病菌,可引起宿主发生多种器官化脓性感染。溶血素(Pyolysin,PLO)是T.pyogenes主要的毒力因子之一,其作为一种外毒素,具有溶解细胞的生物学特性。与其他胆固醇依赖性溶细胞家族(Family of cholesterol-dependent cytolysin,CDCs)相同,PLO蛋白分子具有四个结构域,其第四结构域(Domain 4,D4)的作用是识别并结合细胞膜上的胆固醇。本研究制备出了 5 株针对 PLO D4 的 mAbs(monoclonal antibody,mAb),其中 4 株(2G3、3C8、3G10、4C9)具有较强的抗溶血活性,而3C7的抗溶血活性较低。通过Western-blot法进行表位区筛选,结果表明3C7所针对的表位区位于PLO前体(含27个氨基酸信号肽)的第519-534位氨基酸(amino acid,AA)(以下简称PLO 519-534AA),而具有较强抗溶血活性的4株mAbs所针对的表位区位于PLO前体第487-502位氨基酸(以下简称PLO 487-502AA)处,这段表位区包含了完整的十一肽基序(PLO 491-501AA),证实了十一肽基序对PLO溶血活性有着重要的影响。上述5株mAbs均可以与由T.pyogenes培养物粗纯化获得的天然PLO(wild type PLO,wtPLO)反应。说明5株mAbs可以用于wtPLO的检测。由于2G3的ELISA反应效价显著高于其他4株mAbs,因此使用2G3作为捕获抗体,配合本实验室已保存的HRP标记的抗PLOmAb(HRP-AP-1A3)建立并优化了双抗体夹心ELISA方法。根据此方法检测不同培养时间内TpyogenesHLJ-0912株和T.pyogenes HLJ-1005株分泌在培养液中的wtPLO含量,并在T.yogenes HLJ-0912株培养到10-14 h之间时可以检测到其培养物中的PLO含量。综上所述,本研究成功制备了 5株mAbs,并确定了其所针对的2个表位区;且表明了能够识别十一肽基序的mAbs可以有效抑制PLO的溶血活性。同时使用双抗体夹心ELISA方法对Tpyogenes HLJ-0912株分泌在液体培养基内的PLO进行定量分析,为T.pyogenes的毒力分析提供了依据。
【图文】：

蛋白S,蛋白,步骤

白分子质量标准；1：浓缩后ecular weight marker; 1: The c-1 rPLO 蛋白 SDS-PAGE3-1 SDS-PAGE analysis o见步骤 2.2.1，，经纯化、分子质量标准；1：浓缩后的ular weight marker; 1: The con

蛋白S,质量标准,蛋白,步骤

子质量标准；1：浓缩后的 rPar weight marker; 1: The concenrPLO 蛋白 SDS-PAGE 分析 SDS-PAGE analysis of rPL步骤 2.2.1，经纯化、透析
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4

【参考文献】