鸡白痢沙门菌avrA缺失株的构建及AvrA蛋白抑炎效应的研究

发布时间：2020-06-04 15:40

【摘要】：鸡白痢沙门菌是一种宿主适应性病原菌,多侵害20日龄以内雏鸡,发病率和死亡率极高。成年鸡感染后产蛋率下降,虽临床症状表现并不明显,但可长期带菌,以水平和垂直方式广泛传播病原,给全球特别是发展中国家的养禽业造成巨大的经济损失。三型分泌系统(T3SS)是很多革兰阴性菌用于侵袭宿主细胞的一种类针管注射器状的结构装置。鸡白痢沙门菌能够利用T3SS编码和分泌多种效应蛋白进入真核宿主细胞中。由T3SS1编码的效应蛋白AvrA广泛存在于肠道沙门菌的许多血清型中。不同于其他一些常见的效应蛋白,AvrA虽然由病原菌分泌进入宿主,但它却能够稳定宿主细胞紧密连接,降低炎症和抑制细胞凋亡。目前针对效应蛋白AvrA的研究主要以鼠伤寒沙门菌为模型,但对于其在鸡白痢沙门菌中所发挥功能的研究鲜有报道。蛋白序列分析结果显示,与其它血清型沙门菌的AvrA蛋白相比,鸡白痢沙门菌AvrA蛋白的竣基端缺失了 10个氨基酸。本研究采用λ-Red同源重组技术构建鸡白痢沙门菌avrA基因缺失株,初步探讨了 AvrA与鸡白痢沙门菌致病性的关系,为进一步研究鸡白痢沙门菌感染过程中AvrA蛋白的功能奠定基础。1鸡白痢沙门菌avrA缺失株的构建及其生物学特性鉴定本研究以λ-Red同源重组法对两株鸡白痢沙门菌S06004、C79-13的avrA基因进行了敲除,成功构建了鸡白痢沙门菌S06004、C79-13的avrA基因缺失株。将鸡白痢沙门菌avrA基因和肠炎沙门菌avrA基因分别克隆至质粒pBR322并电转入缺失株中,分别构建了S06004和C79-13回复有本源和肠炎沙门菌avrA基因的回复株,并比较了两株鸡白痢沙门菌野生株、avrA基因缺失株及avrA基因回复株的基本生物学特性。结果显示:avrA基因的缺失不影响S06004和C79-13的生理生化特性,且缺失株具有良好的遗传稳定性。本研究还利用重组DNA技术,在载体pcDNA3.1(+)和pCMV-HA上构建了鸡白痢沙门菌AvrA的真核表达质粒并将其导入大肠杆菌E.coli DH5α,通过间接免疫荧光,鉴定了 AvrA在HeLa等细胞中的表达。鸡白痢沙门菌S06004和C79-13的avrA基因缺失株及其真核表达载体的成功构建为后期研究AvrA在鸡白痢沙门菌致病过程中发挥的作用提供了相应的生物材料。2鸡白痢沙门菌avrA缺失株体外感染过程中调控细胞炎性反应将AvrA真核表达质粒瞬时转染HEK293T、HeLa、LMH细胞后,利用荧光素酶报告基因检测系统分析NF-κB的转录活性。结果显示,AvrA真核表达载体瞬时转染HEK293T、HeLa、LMH细胞后,NF-κB信号通路底物活性下调,表明鸡白痢沙门菌效应蛋白AvrA可以抑制NF-κB的活化。鉴于AvrA在鸡白痢沙门菌中存在部分序列的缺失,我们加入肠炎沙门菌的AvrA进行比较分析,发现鸡白痢沙门菌AvrA对TNF-α诱导的NF-κB通路活性的抑制能力要弱于肠炎沙门菌AvrA,表明在真核转染水平上,鸡白痢沙门菌avrA缺失片段降低其抑制NF-κB通路活化的能力。将鸡白痢沙门菌野生株、缺失株、回复株感染HeLa细胞和Caco-2BBE细胞,检测细胞培养上清的炎性细胞因子表达水平。结果显示,缺失株感染组细胞培养上清中的炎性因子IL-6、IL-8显著高于野生株感染组,说明鸡白痢沙门菌效应蛋白AvrA在沙门菌对宿主炎性反应过程中发挥抑炎效应。另外,回复本源AvrA的回复株感染细胞的培养上清中,炎性因子的水平低于回复外源AvrA的回复株,表明不同血清型中的AvrA只能够在本源血清型沙门菌中发挥更好的抑炎效应。鸡白痢沙门菌野生株S06004和C79-13、avrA基因缺失株及回复株感染HeLa、Caco-2BBE细胞后,Western-blot检测相关通路蛋白的表达情况。结果显示,鸡白痢沙门菌AvrA能够抑制p-JNK、Beclin-1蛋白的表达水平,其avrA基因缺失片段不显著影响AvrA的效应功能,AvrA能够在本源血清型沙门菌中发挥对p-JNK、Beclin-1更好的抑制效果。激光共聚焦结果显示,鸡白痢沙门菌AvrA能够抑制TNF-α诱导的NF-κB p65入核。本研究初步阐明鸡白痢沙门菌AvrA在鸡白痢沙门菌引发宿主炎症反应过程中发挥的抑炎作用。
【图文】：

示意图,沙门菌,示意图,宿主细胞

够编码这两种毒力相关的三型分泌系统，分泌４０多种效应蛋白进入真核宿主细胞［２１－２３］，这逡逑些效应蛋白通过调节宿主细胞信号通路和胞内活动以利于病原菌侵入宿主细胞和在胞内逡逑的存活（图１）。当肠道沙门菌感染宿主后，病原菌与肠道上皮细胞接触，Ｔ３ＳＳ１被激活，逡逑而后Ｔ３ＳＳ１将效应蛋白转运至细胞内，其中部分效应蛋白参与诱导局部细胞膜皱裂以帮助逡逑细菌侵袭。Ｔ３ＳＳ１效应蛋白还触发促分裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）途径的激活，产生促逡逑炎细胞因子，招募多形核白细胞（ＰＭＮｓ），诱导肠道的急性炎症。Ｔ３ＳＳ２存在于所有肠道逡逑沙门菌亚种中，该系统通过转运效应蛋白穿过ＳＣＶ泡进入胞质中，调控胞内ｐＨ酸性环境逡逑和ＳＣＶ泡内的成分，稳定沙门菌与宿主细胞的互作环境［２４］。总之，沙门菌通过Ｔ３ＳＳ系统逡逑把效应蛋白注射入真核宿主细胞中，效应蛋白又通过协同作用的方式发挥效应，改造宿主逡逑细胞的功能，破坏机体的免疫力，建立一个有利于病原菌生存和增殖的胞内环境？，虽然部逡逑分效应蛋白之间的功能相反

效应物,紧密连接,蛋白含量,蛋白

逦３逡逑Ｔ３ＳＳ１效应蛋白ＡｖｒＡ能够稳定紧密连接（图２）邋０１。逡逑ＡｖｒＡ蛋白大小３３ＫＤａ邋（表１），存在于８０％的肠道沙门菌血清型中［３（），３１］，在沙门菌侵逡逑袭的早期由Ｔ３ＳＳ１分泌进入肠道上皮细胞［３２］，，但也有报道称其分泌与Ｔ３ＳＳ２相关［３３］。作逡逑为Ｔ３ＳＳ１的一种效应蛋白，ａｖｒ／４基因序列和假结核耶尔森鼠疫杆菌（逡逑的少ｏ／ｘ／基因以及番前疮痂病辣椒斑点病菌（Ｘ＜３扣／ｚｏｍｏ／~|ｃａｍｐｅ幼Ｉｓｐｖ．逡逑ｖｅｓ／ｃａ／ｏｎ＿ａ）的ａｖ／７？ｘｖ基因序歹！Ｊ相似［３￣。早期研究利用鼠伤寒沙门菌ｐｈｏ－２４及其ａｖｎ４基逡逑因缺失株感染人宫颈癌上皮细胞ＨｅＬａ来研究ＡｖｒＡ的瞬时表达，发现鼠伤寒沙门菌ｐｈｏ－逡逑２４的ａｖｄ基因突变株能够诱导ＰｈｏＱ／ＰｈｏＰ双组份系统的激活，并揭示ＡｖｒＡ可抑制ＮＦ－逡逑ｋＢ路径在果蝇和小鼠模型里，ＪＮＫ和ＮＦ－ｋＢ路径抑制后，先天免疫受阻，炎症和凋逡逑亡加强［３６］？研究发现在假结核耶尔森菌（ＹｏｐＪ／Ｐ）和副溶血弧菌（ＶｏｐＰ）中，ＡｖｒＡ作为一逡逑种乙酰转移酶而存在ＡｖｒＡ过表达的细胞转染模型里
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61

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