褐黄血蜱幼蜱若蜱差异表达基因分析及半胱氨酸蛋白酶功能的研究

发布时间：2020-06-04 19:12

【摘要】：蜱,吸血性体外寄生虫。寄生宿主范围广泛,包括哺乳类、两栖类、禽类等。作为重要的传播媒介之一,蜱在动物体表吸血过程中不仅对宿主动物的皮肤和血管造成机械性损伤,而且还会传播细菌,病毒,无形体,原虫等大量病原体。其在全球各地流行广泛,对人类卫生健康和畜牧业生产引起严重的危害。至今,灭蜱广泛依赖化学杀虫剂,但长期使用化学类药物导致耐药性的逐渐增加,与此同时药物残留问题严重危及到食品安全和生态环境。随着抗蜱疫苗分子的大力发展,蜱功能基因作为保护性抗原大量被挖掘,但蜱体内病原体的多样性特征以及复杂的生理特性可支配宿主动物免疫防御系统,使得保护性抗原对蜱的控制效力不足。此外,这类抗蜱疫苗针对不同蜱的种类其抵抗力也不同。因此了解蜱生理发育特征以及蜱和蜱传病原体之间的相互关系可以为防控蜱和预防蜱传病提供科学理论依据。本研究对中国广西地区采集的蜱样品进行鉴定并统计种类及数量,同时利用反向线性斑点杂交技术检测该地区蜱体内梨形虫感染情况;以褐黄血蜱为研究对象,通过实验室饲养并收集不同发育阶段虫体,描述形态学超微结构,研究其生活史及生物学特性,针对蜱保守基因进行了不同蜱种类之间系统进化分析;利用高通量转录组测序技术对幼蜱和若蜱两个不同发育阶段虫体进行差异基因表达分析;基于转录组测序结果,从若蜱体内鉴定克隆出半胱氨酸蛋白酶编码基因HfCL,进行在不同发育阶段的转录水平分析和不同组织中的定位分析,同时对重组蛋白rHfCL的酶活性及其体外抑制巴贝斯虫的特性等进行了研究。主要结果如下:(1)形态学鉴定中国广西34个地区671份蜱样品,其中有血红扇头蜱R.sanguineus64.08%(430),镰形扇头蜱R.haemaphysaloides 1.64%(11),长角血蜱H.longicornis32.63%(219),微小牛蜱R.microplus 1.34%(9),具角血蜱H.cornigera 0.29%(2);利用梨形虫18s rRNA基因种属特异性引物和探针,反向线性斑点杂交检测蜱体内梨形虫携带情况,该调查地区蜱体内主要携带沃氏巴贝斯虫B.vogeli,水牛泰勒虫T.buffeli,吕氏泰勒虫T.luwenshuni,环形泰勒虫T.annulatay其阳性率分别为3.13%(21),8.94%(60),0.89%(6),0.89%(6)。此外,蜱体内梨形虫混合携带的样品有8份其阳性率为1.19%(8)。(2)通过饲养褐黄血蜱了解其生活史及生物学特性,其最适生长温度为28±1℃,相对湿度88%,属于三宿主蜱。针对不同发育阶段的蜱形态学进行鉴定描述,其形态特征主要以躯体整体呈褐黄色,假头基呈矩形其后部颈沟深,无眼,基突短而钝,须肢短而包裹口下板,生殖孔呈心型,肛沟较深围绕肛门后缘,肛门呈纽扣状并左右分为两个半月型,气门板呈豆状凸起,缘垛整齐均匀排列共11个,雌蜱盾板无斑点并呈亚圆形。以褐黄血蜱基因组DNA为模板,分别扩增克隆16s rRNA和cox 1基因序列,与同源物种序列比对并构建系统进化树,分析结果表明褐黄血蜱在不同地区的物种进化并无差异,与青海血蜱和台湾血蜱的进化关系相近,形成一个独立的分支,与扇头蜱属的蜱亲缘关系较远。(3)利用Illumina平台进行RNA-seq分析褐黄血蜱饥饿幼蜱和若蜱两个发育阶段差异表达基因,结果表明,幼蜱和若蜱两个文库Raw Reads数量分别为62538796,71175770;Clean Reads数量分别为59871570、69519916。利用Nr、GO、KEGG等数据库对拼接后的转录本进行功能注释,获得的Unigene经过FPKM算法进行差异表达的分析,结果表明在若蜱发育阶段上调的基因有56个,在幼蜱发育阶段上调的基因有24个。差异基因主要集中在角质蛋白,内切几丁质酶,半胱氨酸蛋白酶,核酸内切酶,核酸外切酶,蜱相关假定蛋白,脱氧核糖核酸酶,细胞色素酶,蛋白酶激活因子,半胱氨酸蛋白酶抑制剂等。(4)依据转录组测序数据,从褐黄血蜱若蜱体内克隆到半胱氨酸蛋白酶编码基因HfCL,利用RACE方法获得基因全长cDNA序列为1216 bp,其中包括CDS序列1041bp共编码346个氨基酸,5’UTR部分38 bp,3’UTR部分137 bp。与同源氨基酸序列比对并构建系统进化树分析表明,HfCL属于木瓜蛋白家族蛋白酶的L型半胱氨酸蛋白酶。荧光定量PCR结果表明HfCL在卵和饥饿虫体各个发育阶段均有表达,其中若蜱和雌雄成蜱的表达量显著高于幼蜱,而在卵发育阶段的转录水平相对于幼蜱差异不显著。随后,原核表达HfCL基因CDS序列,分离纯化重组蛋白rHfCL分子量为36 kDa并免疫小鼠获得特异性多克隆抗体血清。免疫组化法检测HfCL在蜱肠道和唾液腺中均有表达。通过水解半胱氨酸蛋白酶特异性荧光底物对重组蛋白rHfCL进行酶活性分析,结果表明在pH 6并且蛋白酶浓度在16μM条件下酶活性达到相对最大值。重组蛋白rHfCL体外抑制巴贝斯虫试验结果表明,不同浓度rHfCL抑制巴贝斯虫裂殖体增长的效率也不同,100μg/mL浓度的重组蛋白rHfCL对田鼠巴贝斯虫裂殖体增长抑制效果最佳,而250μg/mL浓度的重组蛋白rHfCL对吉氏巴贝斯虫裂殖体抑制增长效果最佳。本研究首次通过反向线性斑点杂交技术对中国广西蜱体内感染梨形虫潜在风险进行了评估;建立实验室饲养褐黄血蜱平台,掌握其生活史,生物学特性和形态学特征;利用高通量转录组测序技术分析褐黄血蜱幼蜱若蜱两个发育阶段的差异表达基因;从褐黄血蜱若蜱体内分离鉴定一种新型半胱氨酸蛋白酶并研究其功能,为蜱及蜱传病的防控提供依据。
【图文】：

蜱传,性病,硬蜱

华中农业大学 2018 届博士研究生学位论文细胞引起的疾病，如巴贝斯虫病在畜牧养殖业危害较严重，其中牛巴贝斯虫病主要是由微小牛蜱 Microplus boophilus，镰形扇头蜱 Rhipicephalus haemaphysaloides 等硬蜱寄生于牛体表使得宿主感染双芽巴贝斯虫 Babesia bigemina，东方巴贝斯虫Babesia orientalis，牛巴贝斯虫 Babesia bovis (Antunes et al., 2012; Bock et al., 1999;Huang et al., 2015)。经蜱传播的泰勒虫主要寄生于哺乳动物红细胞，巨噬细胞，淋巴细胞等具有较强的致病性 (Schnittger et al., 2000)。也有地区报道，经蜱传播的田鼠巴贝斯虫感染人的案例 (Hildebrandt et al., 2007)。上述血液原虫病引起的主要症状表现为食欲不振，，精神不振，贫血，消瘦，黄疸，发热，严重者可以导致死亡(Srivastava and Sharma 1981; Terletsky and Akhmerova 2005)。莱姆病 Lyme borreliosis也是经蜱感染的螺旋体自然疫源性疾病，主要在欧洲、北美洲，以及部分非洲地区的人类感染，临床症状为皮肤呈游走性红斑，心脏、神经和关节等多系统、多脏器损害，其传播媒介主要以蓖子硬蜱 Ixodes ricinus，肩突硬蜱 Ixodes scapularis 为主(Aguerorosenfeld et al., 1995; Kerr 2012)。

硬蜱,生活史,宿主

蜱可化分为一宿主，二宿主和三宿主蜱。生活史如（图 1-2），成蜱寻找适宜宿主在其体表寄生吸食血液并完成交配，完全吸饱血的雄虫离开宿主体表并死去，雌虫吸饱血后离开动物体表开始寻找适宜的地方进行产卵；幼蜱是经虫卵胚胎发育孵化而来，具有一定活性的幼蜱找到适宜的宿主寄生并进行第一次吸血，完全饱血后离开宿主，经蜕皮发育至若蜱；完全蜕皮后的若蜱待体内血液消耗干净再寻找新的宿主并进行第二次寄生吸血，蜕皮发育为成蜱。符合上述描述生活周期的蜱也称为三宿主蜱。完整的生活周期中更换两次宿主的蜱称之为二宿主蜱，无需更换宿主的称之为一宿主蜱。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.746

【参考文献】