EDC3蛋白与PRRSV作用关系的探究

发布时间：2020-06-04 22:03

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus,PRRSV)是一种高度传染性病毒,属于套氏病毒目(Nidovirales)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)。由PRRSV引起的猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)以引起各年龄段生长猪呼吸系统疾病和繁殖障碍为特征,是危害各国养猪业最重要的世界性经济疾病之一,目前缺乏有效的防控措施。mRNA脱帽增强因子3(Enhancer of mRNA decapping 3,EDC3)也称LSm16、DCP3和YJDC,属于LSm蛋白家族成员。EDC3定位于mRNA处理小体(Processing bodies,P-Body),是P-body重要组件蛋白。P-body是细胞质内参与转录后调控的mRNA蛋白复合体,其组件蛋白与病毒存在相互作用关系。EDC3可激活包括DCP1、DCP2在内的脱帽酶活性,参与mRNA 5’→3’降解过程。为探究PRRSV增殖过程中与EDC3蛋白的相互作用关系,本研究以从江香猪和Marc145细胞源EDC3基因为研究对象,通过克隆、测序获得EDC3基因编码区序列;建立EDC3基因qPCR方法,分析从江香猪不同组织间EDC3转录水平的差异;采用过表达与基因干扰技术,从基因的转录、蛋白表达水平初步探究EDC3蛋白与PRRSV增殖之间的作用关系,为进一步探索EDC3蛋白与PRRSV相互作用机制奠定基础,为防控PRRSV提供新策略。1.EDC3基因的克隆与生物信息学分析。利用RT-PCR方法对从江香猪、Marc145细胞源EDC3基因编码区序列进行扩增,并通过分子克隆技术将其克隆至pMD-19T载体构建重组质粒;采用生物信息学方法对获得EDC3序列进行分析。结果表明,从江香猪源EDC3基因长度为1404 bp,与预期大小相比缺少123 bp,缺失位置在277-399位碱基;Marc145细胞源EDC3基因长度为1527 bp,与预期大小相符;从江香猪与预测野猪(GenBank登录号:XM_001927872)源EDC3核苷酸序列相似性最高,为99.7%;Marc145细胞与绿猴(GenBank登录号:XM_008015876)源EDC3核苷酸序列相似性最高,为99.2%。EDC3具有LSm家族蛋白经典结构域,包括LSm结构域、FDF结构域、YjeF_N结构域;EDC3蛋白二级、三级结构域预测结果表明无规则卷曲和α-螺旋可能是其优势结构;EDC3是亲水性蛋白,有多个抗原表位,无信号肽,不存在跨膜结构域。2.从江香猪EDC3基因荧光定量PCR方法的建立及其在不同组织的表达分析。建立香猪EDC3基因的qPCR方法,并对从江香猪不同组织EDC3的转录水平进行分析。结果表明,EDC3基因在从江香猪肝、心、脾、肺、肾、腹股沟淋巴结中均有表达;在淋巴和脾脏等免疫器官转录水平相对较高,在肺脏中则最低,说明EDC3基因在从江香猪不同组织中呈不同程度分布。3.PRRSV增殖对EDC3表达的影响。Mac145细胞分别在0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h感染PRRSV,收集细胞,提取RNA进行反转录;利用qPCR方法检测N基因、EDC3基因的mRNA水平,分析PRRSV增殖时对EDC3基因mRNA水平的影响。结果表明,正常情况下Mac145细胞中EDC3的mRNA水平在12 h-36 h趋于平稳;感染PRRSV后,随着病毒的增殖,宿主细胞中EDC3的转录水平在24 h、36 h时显著下调。说明PRRSV在增殖过程中对宿主细胞EDC3的mRNA水平有一定影响,本试验结果为进一步研究EDC3蛋白与PRRSV的作用关系奠定基础。4.EDC3蛋白对PRRSV增殖的影响。利用分子克隆技术构建携带猪源、猴源EDC3基因的真核表达质粒,采用脂质体瞬时转染技术将携带EDC3基因的重组质粒转染于Marc145细胞,利用IFA技术分析外源EDC3在Marc145细胞中的定位、通过qPCR及Western Blot方法对EDC3和PRRSV N基因的表达情况进行分析,探究EDC3过量表达时对PRRSV增殖的影响;合成针对Marc145细胞内源EDC3 siRNA干扰引物,利用脂质体将其转染至Marc145细胞,探究抑制EDC3表达时对PRRSV增殖的影响。结果表明,经双酶切、测序验证,本研究成功构建了猪源、猴源真核重组质粒pcDNA3.1-pEDC3、pcDNA3.1-mEDC3,猴源EDC3定位于Marc145细胞胞浆内;过量表达EDC3并感染PRRSV时,PRRSV N的mRNA、蛋白水平下调,说明EDC3过量表达时可抑制PRRSV的增殖;EDC3 siRNA干扰片段转染细胞后成功干扰了EDC3的表达,同时感染PRRSV后,PRRSV N的mRNA、蛋白水平皆上调,说明抑制EDC3表达能促进PRRSV增殖。试验结果为进一步探究EDC3蛋白与PRRSV增殖之间的作用机制奠定了基础。
【图文】：

Marc145细胞,PCR扩增,基因,猪源

因编码蛋白信号肽预测alP 4.1 在线服务器（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）因编码区 RT-PCR 结果猪源 cDNA 为模板，经套式 PCR 扩增，PCR 产物经 1.0% cDNA 为模板，经特异性引物 PCR 扩增，PCR 产物经 1.到约 1500 bp 左右条带，与预期大小相符，结果如图 1-1。M1bpM1bp

菌液,Marc145细胞,细胞,生物信息学分析

A: 从江香猪 EDC3 菌液 PCR 验证; B: Marc145 细胞源 EDC3 菌液 PM: DL 2000 DNA Marker; 1: 从江香猪、Marc145 细胞源 EDC3Fig.1-2 A: PCR Verification of EDC3 gene in Xiang Pig;B: PCR Verification of EDC3 gene in Marc145 cellsM: DL 2000 DNA Marker; 1: Xiang pig, Marc145 cell-derived EDC3因生物信息学分析结果测序分析结果R 验证为阳性的菌液送英潍捷基贸易有限公司进行测序，获对结果显示：从江香猪源 EDC3 基因长度为 1404 bp，与预缺失部位在 277-399 碱基，，如图 1-3 所示；Marc145 细胞源，与预期大小相符。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.651

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