A型口蹄疫病毒衣壳蛋白主要抗原表位区的原核表达及免疫效果分析

发布时间：2020-06-05 07:07

【摘要】：口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的急性高度接触性动物传染病,主要感染猪、牛与羊等偶蹄动物,造成了严重的经济损失和社会影响。防控FMD仍然是每年我国动物防疫工作的首要任务。目前,我国对FMD主要采取疫苗免疫为主的综合性防控措施,其中灭活疫苗应用最为广泛,但灭活疫苗在生产与使用过程中存在病毒逃逸的安全风险,需要开发新型疫苗来应对未来FMD的防控问题。其中表位疫苗是最具有潜力的FMD新型疫苗之一。2013年A型FMDV SEA/97-G2亚型毒株传入我国后,造成了巨大的经济损失,为了进一步探明当前A型FMDV衣壳蛋白的主要抗原表位区及其免疫原性,原核表达了A型FMDV衣壳蛋白的主要抗原表位区并进行了免疫效果评价,以期为A型FMDV表位疫苗的研究提供线索。根据已鉴定的FMDV A型毒株的主要抗原位点,结合基因序列比对结果,选择了当前A型FMDV流行毒株的主要抗原位点区:包括A/QH/CHA/2013的VP2 70~81位、118~140位,VP1G-H环131~157位、C末端188~212位;A/WH/CHA/09 FMDV VP1 43~48位,VP3 55~72位;以及非结构蛋白3A中的T细胞表位和通用性T细胞表位,用于构建免疫原分子。通过柔性Linker将各表位基因串联,在串联基因的3'端融合了6个His标签,构建了含多个抗原表位基因的原核表达载体pET28a-ANX2和pET28a-ANX3,其中pET28a-ANX2采用了氨基酸反向串联的方式;通过SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定目的蛋白ANX2和ANX3的表达。将ANX2和ANX3表位蛋白大量表达和纯化后,与CpG-ODNs和ISA201乳化后免疫小鼠和猪,对目的蛋白诱导宿主体液免疫和细胞免疫应答水平进行了鉴定,并在免疫后28日用流行毒株对免疫猪进行了攻毒试验,评价疫苗的保护效力。研究结果表明,表位重组蛋白ANX2和ANX3表达形成包涵体,蛋白分子质量分别约为41kDa和39 kDa,Western blot鉴定均能与A型FMDV阳性血清特异性反应;免疫小鼠和猪后能产生抗A型FMDV抗体,细胞因子IFN-γ和IL-4也有明显升高,攻毒后对猪有一定的保护作用;ANX2的免疫原性略高于ANX3,证明氨基酸反向串联方式的串联更有利于重组蛋白展示抗原表位,从而增强其免疫效果。本研究为A型FMDV表位疫苗的研究积累了数据。
【图文】：

变的-C 末端(Gonzalez-Magaldi et al., 2015)。3A 蛋白含有疏水基，能够介导胞膜结合，，促进病毒进入易感细胞(姚怀兵, 2017)。3A 或 3AB 蛋白的稳定表复制，包括增加病毒空斑的形成和病毒滴度(Rosas M F., 2008)。研究表明和宿主范围方面起着重要的作用，3A 蛋白中一些 aa 的替换和删除会导致 F的改变(Beard., 2000)。FMDV 3ABC 蛋白可以用来区分猪和牛的感染与免疫开发了 3AB-ELISA 和 2C3AB-ELISA 用于净化 FMDV(Lu et al., 2010)。3B组成，分别编码 VPg（3B1）、VPg（3B2）、VPg（3B3），供价连接到基因 上，它可能是一个包装信号，促进完整病毒粒子的形成(刘庆军, 2005)。3C蛋白的裂解，在许多小 RNA 病毒中（例如肠道病毒，脊髓灰质炎病毒）3C点含有谷氨酰胺（Glutamine, Gln）残基，但是 FMDV 3C 蛋白在其识别序 P1 区中含有包含谷氨酸（Glutamicacid, Glu）或 Gln 残基的裂解位点 (Krist蛋白是一种 RNA 聚合酶，在 FMDV 不同的血清型以及亚型之间是高度保守制合成过程中用于 RNA 的合成(Jeong., 2015)。而且，3D 蛋白还具有催化作其进行 VPg 的尿苷酸化，具有 RNA 聚合酶和末端腺苷转移酶的作用，分别 RNP 复合物来发挥作用(刘庆军, 2005)。因此，3D 在 FMDV 的生命周期中

抗原表位的分类主要有两种，根据抗原表位中氨基酸空间结构特点，构象性表位；根据 T、B 细胞所识别的抗原表位的不同可分为 B 细胞表原表位鉴定方法主要包括肽扫描技术、氨基酸定点突变技术、X-ray 技术以及噬菌体展示肽技术(文雪霞, 2012)。近年来随着生物技术的发服了传统方法耗时长、费用高的缺点，能够更便捷快速地鉴定抗原表位，A 型、O 型、C 型 FMDV 的核酸序列大约有 86%的序列相同，A 型类似于 O 型，这些为抗原表位的筛选提供了重要依据(Fry et al., 2005) O 型 FMDV 的抗原位点 FMDV 至少有 5 个抗原位点。Fry 等总结了 O 型 FMDV 的抗原位点：和 C 末端，G-H 环是主要的抗原位点，能够诱导高水平中和抗体，关 158 位，C 末端的关键 aa 是第 208 位；位点 2 位于 VP2 上的 BC 环和跨β-股的两端，关键 aa 是第 70～73 位、75 位和 77 位，EF 环上的关；位点 3 位于 VP1 上的 BC 环上；位点 4 位于 VP3 的β-B‘结节’，；位点 5 位于 VP1 上，关键 aa 为第 149 位(Fry et al., 2005)。这些抗原择提供了理论依据。如图 1.2。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.4

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本文编号：2697691