腐败梭菌α毒素单抗、多抗的制备及DAS-ELISA方法的初步建立

发布时间：2020-06-05 06:17

【摘要】：腐败梭菌(Clostridium septicum)在土壤等自然界环境中分布十分广泛,是造成动物和人类恶性水肿病的主要病原体。该细菌感染羊后主要引发羊快疫,发病羊在2-3天内迅速死亡,给我国畜牧行业带来重大损失。因此,迫切需要建立一种针对羊快疫等腐败梭菌病的早期诊断方法,以做到对临床可疑发病样品的快速筛查。腐败梭菌最主要毒力因子为α毒素,该毒素具有溶血、致死和坏死等多种生物学活性,因此本研究以α毒素为主要研究对象,通过制备α毒素单克隆抗体及多克隆抗体,完成对双抗体夹心ELISA(Double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA)检测方法的初步探索,为羊快疫等腐败梭菌病的早期临床诊断提供技术支持。研究内容可分为以下三个部分:1、腐败梭菌天然α毒素与重组毒素蛋白的制备将腐败梭菌参考株(ATCC 12464)进行菌种复苏和增菌培养后,粗提腐败梭菌天然蛋白,使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)对提纯后的蛋白进行验证,获得大小为46 kDa的天然α毒素。根据NCBI上公布的腐败梭菌α毒素的CDs区序列,扩增α毒素基因,构建腐败梭菌α毒素原核表达系统,并在最佳诱导条件下(菌液OD_(600nm)为0.4-0.6时,向菌液中加入浓度为0.5 mmol/mL的IPTG,37℃条件下诱导表达5 h)大量表达可溶性重组蛋白并纯化,最终测得目的蛋白浓度为4.28 mg/mL。通过Western blot分析表明该蛋白具有良好的免疫原性,证明腐败梭菌α毒素原核表达系统构建成功。2、单克隆抗体及多克隆抗体的制备使用灭活后的重组α毒素蛋白免疫新西兰大白兔,将获得的阳性血清利用抗原亲和层析方法进行纯化,获得纯化后的多克隆抗体浓度为0.98 mg/mL,多克隆抗体对重组蛋白效价检测结果为1:256000,对天然α毒素效价检测结果为1:128000,通过SDS-PAGE及Western-blot检测结果发现该多克隆抗体纯度高,特异性良好。使用灭活后的重组α毒素蛋白免疫BALB/c小鼠,小鼠血清转阳后制备脾细胞并进行细胞融合,通过杂交瘤细胞筛选及亚克隆实验,最终确定8株强阳性细胞株。通过稳定性检测发现有6株细胞可以稳定分泌单克隆抗体,其中3E8、6B12和6F10细胞株对天然α毒素的识别能力较强。选取其中的两株细胞3E8和6B12,分别腹腔注射免疫BALB/c小鼠,收集腹水并纯化后,通过间接ELISA测得两株单抗对重组蛋白效价检测结果为1:256000,对天然α毒素效价检测结果为1:128000,两株单抗浓度分别为2.27mg/mL和1.96 mg/mL,通过SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定单抗纯度及特异性,结果发现制备的两株单克隆抗体纯度高,特异性良好。3、针对腐败梭菌α毒素DAS-ELISA的初步建立为建立高效、灵敏的DAS-ELISA方法,探索最佳配对抗体及抗体工作浓度,本研究将多克隆抗体作为捕获抗体,将单抗3E8和6B12分别作为检测抗体,通过方阵滴定实验,确定作为捕获抗体的多克隆抗体的最佳工作浓度为1.25μg/mL,作为检测抗体的单抗3E8的最佳工作浓度为0.5μg/mL。在优化条件下验证该方法的特异性,结果表明该方法仅对腐败梭菌重组α毒素和天然α毒素具有识别作用,与其他蛋白无交叉反应,特异性良好。本研究成功构建了腐败梭菌α毒素重组蛋白的原核表达系统,在最佳诱导条件下大量诱导表达可溶性的目的蛋白,并以α毒素重组蛋白为基础,成功制备出针对腐败梭菌α毒素的特异性强,稳定性好的单克隆抗体及多克隆抗体。初步摸索出DAS-ELISA的最佳配对抗体及最佳抗体工作浓度,并验证了优化后的DAS-ELISA的特异性。为家畜腐败梭菌病的临床诊断提供了技术方法,也为腐败梭菌病疫苗和相关药物的研发提供了技术支撑。
【图文】：

腐败梭菌

1 电子显微镜观察腐败梭菌 (引自 Macfarlane et al., 20e 1 Transmission electron micrographs of a C. septicum swa人、马、牛、绵羊、猪、犬、猫、鸡等，伤感染可致人的气性坏疽，马、牛、羊、, 2012)，消化道内源性感染可致牛、绵羊, 2017)。在土壤中发现的腐败梭菌也是从，腐败梭菌可以感染有肝吸虫寄生的宿主体中分离出来，，死亡绵羊的坏死肝脏中同四种外毒素，通过血清学研究和酶活性研的实体。它们包括致死和坏死毒素（α毒和巯基活化毒素或脓毒素（δ毒素）。而其菌产生。通过补体结合试验、免疫荧光和

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其中前31个氨基酸为信号肽序列，是疏水性结构。该毒素与嗜水气单胞菌的气溶素在结构及生物学特性等方面类似，同源度高达72%。α毒素结构如图2所示，对其功能位点研究表明，第398位的精氨酸是控制α毒素体外活化最关键位点，该位点是弗林蛋白酶的识别位点，前体毒素需要经过弗林蛋白酶水解后才能够形成活化形式(Gordon et al., 1997; 彭国瑞, 2013)。而靠近C端的第302-312位氨基酸是α毒素与糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）锚定蛋白的结合位点(Mukamoto et al., 2013)，双亲性跨膜结构（第204-231氨基酸结构）主责α毒素的造孔功能(Melton et al., 2004; Jody A. MeltonWitt et al., 2006)。此外，有研究表明，同时突变S189C和S238C两位点后，会使α毒素失去细胞毒性(Shin et al., 2004)。腐败梭菌能够产生一种单一的致死因子α毒素。Bernheimer等于1944年首次描述了α毒素(Bernheimer, 1944)，后来Ballard等人对分离出的α毒素进行了表征(Ballard et al.,1992)。腐败梭菌α毒素是属于细胞外毒素的气溶素家族的一种成孔毒素。虽然成孔毒素由于对红细胞的溶解作用而通常被认为是一种溶血素
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.616.3

【参考文献】