外泌体介导的口蹄疫病毒感染机制研究

发布时间：2020-06-06 01:02

【摘要】：外泌体(exosomes)是一类能够转运蛋白、脂质和核酸等物质的胞外双层膜囊泡。病毒感染后,宿主细胞分泌的外泌体携带有病毒或宿主细胞活性成分,该外泌体参与调控病毒感染或者宿主免疫反应。口蹄疫病毒(FMDV)感染后,宿主细胞分泌的外泌体在FMDV感染中的作用及机制尚不清楚。本研究以FMDV感染细胞释放的外泌体(FMDV-exosomes)与未感染细胞释放的外泌体(MOCK-exosomes)为研究对象,揭示FMDV-exosomes在FMDV感染中的作用及机制,主要内容如下:1.FMDV-exosomes的分离鉴定及成分分析本研究使用FMDV(A/GDMM/CHA/2013)感染猪肾传代细胞PK-15,收集感染细胞上清,使用差速离心结合免疫纯化的方法分离纯化FMDV-exosomes;使用蛋白质免疫印迹(WB),透射电镜(TEM)和动态光散射(DLS)三种方法检测分离纯化产物,结果均符合外泌体定义,证实分离到该外泌体。将FMDV基因组分成7个片段,提取FMDV-exosomes中RNA,RT-PCR可以成功扩增到7个片段,证明FMDV-exosomes中含有全长FMDV核酸序列。使用液相二级质谱(LC-MS/MS)鉴定FMDV-exosomes蛋白表达谱,共鉴定到1133个宿主蛋白和9个FMDV蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、2B、2C、3A、3C、3D);同时使用稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株验证质谱结果,发现绿色荧光(外泌体)中包裹有红色荧光(FMDV-VP3),证明FMDV-exosomes中含有FMDV蛋白。2.FMDV-exosomes与FMDV感染使用DiO标记(绿色)FMDV-exosomes,将其孵育PK-15细胞,共聚焦显微镜观察到胞内有绿色荧光,证明分离的FMDV-exosomes能够进入宿主细胞。将FMDV-exosomes接种PK-15和IBRS-2细胞,FMDV-exosomes均能使两种细胞产生病变,且qRT-PCR能检测到病毒复制,证明FMDV-exosomes能够感染FMDV易感细胞。将FMDV-exosomes接种RAW264.7细胞,qRT-PCR检测到病毒复制,证明FMDV-exosomes能够侵染FMDV非易感细胞。使用FMDV中和抗体处理FMDV-exosomes,将其孵育PK-15细胞,FMDV-exosomes仍然能够感染PK-15细胞,证明FMDV-exosomes感染细胞能力不受中和抗体影响。为进一步验证FMDV-exosomes致病性,将FMDV-exosomes接种3日龄Balb/C乳鼠,48 h出现乳鼠死亡现象,且检测到FMDV复制,证实FMDV-exosomes内的FMDV成分能够在体内复制。3.FMDV-exosomes与FMDV复制使用BCA蛋白浓度检测方法定量FMDV-exosomes与MOCK-exosomes总蛋白量,将等量样品分别孵育PK-15细胞,接种FMDV,qRT-PCR检测发现孵育FMDV-exosomes组FMDV载量更低。使用si-Rab27a干扰宿主蛋白Rab27a(抑制外泌体分泌),接种FMDV,qRT-PCR检测发现胞内胞外病毒载量均比对照组高;使用0、5、10μmol/L GW4869(抑制外泌体形成)处理细胞,接种FMDV,qRT-PCR检测发现胞内胞外病毒载量均比对照组高,且呈剂量依赖性。上述结果证明FMDV-exosomes抑制FMDV复制,减少外泌体分泌量有利于FMDV复制。为探究FMDV-exosomes通过何种途径抑制病毒复制,将FMDV-exosomes分别接种PK-15、Vero、RAW264.7细胞,发现FMDV-exosomes在三种细胞上均能上调TNF-α转录。4.FMDV复制与外泌体释放使用WB方法检测FMDV感染组与未感染组外泌体标志蛋白表达量,采用BCA蛋白浓度检测方法定量外泌体总蛋白量,均发现FMDV感染组分离到的外泌体相比未感染组少,证明FMDV复制降低了外泌体分泌量。将FMDV接种PK-15细胞,结果证实随着FMDV复制,宿主蛋白Rab27a降解增多;分别使用CQ、NH_4Cl、Z-VAD-FMD、MG132四种蛋白降解抑制剂处理PK-15,然后接种FMDV,发现CQ(抑制自噬溶酶体途径)处理后,FMDV不能有效降解Rab27a;以上结果证明FMDV通过自噬溶酶体途径降解Rab27a。WB检测发现过表达Rab27a后再接种FMDV,外泌体分泌量没有减少,证明FMDV通过降解Rab27a抑制外泌体分泌。同时,WB检测发现过表达Rab27a抑制了FMDV复制,说明FMDV通过抑制外泌体分泌从而促进FMDV复制。过表达FMDV 12个编码蛋白,发现FMDV-2C降解宿主蛋白Rab27a,且呈剂量依赖性。进一步研究发现FMDV-2C能够降低外泌体分泌量。
【图文】：

图 1-1 FMDV 基因组示意图（引自 Peter W. Mason et al 2003）Figure 1-1 Schematic representation of the FMDV genome (adapted from Peter W. Mason etal 2003)1.1.2 口蹄疫病毒致病机制最近的研究已经证实，FMDV 在猪上偏好通过上消化道进入（Fukai et al2015）。Alexandersen 等人报道在病毒感染后 24~48 h，猪只背腭软腭和扁桃体中FMDV RNA 含量最高（Alexandersen et al 2001）。实验条件下通过物理隔离即可有效的阻止 FMDV 传播，但直接接触会造成猪群 FMDV 快速传播（Pacheco and Mason2010, Stenfeldt et al 2016b）。FMDV 感染后，口咽的上皮组织是早期感染期间病毒复制的主要部位，之后，在水泡病变中（次级复制位点）发生大量病毒扩增（Stenfeldt et al 2016a）（图 1-2）。在猪上，，病毒血症可以在自然或人为病毒感染后的 24 h 内被检测到，并且通过口咽途径大量排出感染性病毒粒子。通常在病毒血症发生后 24 h，能够发现发烧、食欲不振、口鼻蹄等处水疱等临床症状（Stenfeldt et al 2014）。

D 感染猪不同阶段组织中病毒分布示意图（引自 Carolina Stenfeldt e Schematic diagram of virus distribution in different stages of FMD in pifrom Carolina Stenfeldt et al 2016)疫病毒拮抗宿主天然免疫机制感染期间，病毒与宿主存在共同进化的情况： 方面，宿主过激发炎症反应抑制病毒的增殖、扩散；另 方面，病毒也力，但这 行为也要避免过度反应，保证宿主细胞存活以便yen et al 2017）。与所有病原体 样，机体能够识别 FMDV 的 I 型和 III 型干扰素（IFN）反应。同样的，FMDV 也会通统的清除作用。这些方式（Medina et al 2018）包括：（1） IFN 的诱导表达；（2）抑制蛋白质转运；（3）阻断先天免翻译后修饰；（4）调节自噬相关通路；（5）抑制应激颗粒疫细胞功能。-VP2 通过 HSPB1 激活自噬反应（Sun et al 2018）；FMDV-VP
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65

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本文编号：2698892