湖南省PCV2遗传变异及抗体压力下Cap氨基酸位点选择分析

发布时间：2020-06-06 04:07

【摘要】：猪圆环病毒病是有猪圆环病毒2型引起的系统性免疫功能紊乱疾病。猪圆环病毒2型可分为2a,2b,2c和2d共4种基因亚型,其中2d亚型报道逐渐增多,基于PCV2a/PCV2b基因型疫苗对PCV2d保护效果成为需要关注问题。为此我们调查研究湖南省内PCV2时间分布规律,疫苗田间有效性评估及抗体压力下对PCV2-Cap蛋白氨基酸正向选择作用,以期为PCV2疫苗免疫和更新提供指导和背景信息。本研究中建立了一种快速提取组织样本、细胞培养物和血清中DNA的方法并进行了评估。通过棋盘法优化盐酸胍和十二烷基磺酸钠溶液浓度,最终确定盐酸胍和十二烷基硫酸钠溶液使用浓度分别为3M和10%,并与酚仿法对比。两种方法所提取的DNA浓度和纯度相近,对DNA进行普通PCR和定量PCR分析,两者无显著差异。该方法操作过程均在同一离心管内进行,极大的降低了交叉污染机会,而且该方法操作简便,可快速的检测大量样本,应用于DNA病毒的分子流行病学调查,为本实验的后续研究提供了基础。为了解湖南省内PCV2流行性及分子遗传变异趋势,通过对Genbank内收录PCV2全基因组序列分析,设计可用于PCV2检测及亚型鉴别诊断引物。应用PCR方法检测本实验室收集于2006-2016年生猪病料样本内PCV2核酸,阳性样本进一步使用亚型分型引物鉴定。随机选取部分核酸阳性样本进行全基因组测序,并与Genbank内序列全基因组重组分析和进化分析。2006-2016年11年间PCV2总检出率62%,各年份检出率介于36.8%-89.1%。PCV2a检测结果为阴性;PCV2b阳性率介于31.4%-63.6%,2006-2016年呈逐年下降趋势;PCV2d阳性率介于48.5%-80%,2006-2016呈逐年上升趋势。2006-2007年PCV2b占优,但是2008年后PCV2d成为主要流行基因亚型。PCV2b/PCV2d混合感染2006-2008年间呈现小幅上升,随后稳定于10%左右(PCV2b同源性,PCV2d同源性)。54条实验序列中有27.78%发生重组且均发生在ORF1区域。进化分析显示实验序列中有26条为PCV2b,28条为PCV2d。为评估PCV2疫苗免疫效果,选择不同免疫时长猪场内不同年龄猪采样并进行PCV2抗体和病毒血症检测,对检测为阳性的血清样品进行PCV2亚型分型检测和病毒载量测定。2016年血清样本中IgG阳性率阳性率抗体水平普遍高于2013年血清样本。非免疫场内PCV2核酸阳性率高于免疫场,免疫时间短的猪场核酸阳性率高于免疫时间长的猪场。2013年免疫场内流行的基因亚型以PCV2d为主,而非免疫猪场则以PCV2b为主;2016年两个未免疫猪场中一个以PCV2d为主要流行基因亚型,另一个猪场与2013年该猪场流行基因亚型一致,以PCV2b为主;免疫猪场均以PCV2d为主。两个年份中均有两个基因亚型混合感染现象。血清中病毒载量检测结果显示2016年未免疫猪场内外观正常猪血清中病毒载量较高(最高5.5×10~7copies/ml),而免疫3年左右猪场内PCV2病毒含量比未免疫猪场病毒含量低(2000copies/ml),免疫5年以上猪场PCV2病毒载量最低(500copies/ml)。选择来自于PCV2疫苗非免疫场和免疫场PCV2信号较强30份,扩增ORF2基因并测序,将分离序列与ORF2各基因型参考序列进行遗传进化分析,结果PCV2b和PCV2d基因型的序列数量比例为11:19。收集来自于网络的ORF2序列并将其分别整理为疫苗免疫前和疫苗免疫后2个数据集,每个数据集进一步分为中国及其他主要养猪国家ORF2序列,并根据基因型分类整理。通过网络DataMonkey软件分别计算各数据集内ORF2氨基酸阳性选择位点,最终通过通过SWISS和PyMol模拟展示阳性位点所处位置。使用疫苗后PCV2-Cap氨基酸正选择位点均增多,国内数据由2个位点(位点89和151)增多至4个(位点90、121、191和215),国外数据由1个位点(位点191)增多至5个(位点30、63、122、186和234),疫苗使用加速了PCV2-ORF2氨基酸位点进化;其中位于中和抗原表位区域的氨基酸变化(位点63、89、90和121),有可能影响疫苗免疫效力。结论:PCV2d基因亚型2008年已成为湖南猪群中普遍流行基因亚型;疫苗对PCV2b和PCV2d基因亚型毒株均具有保护作用,免疫可降低猪体内病毒含量,降低带毒猪散毒机会及降低猪群间病毒传播频率;长期坚持合理免疫程序和剂量,有可能完全清除猪群中病毒循环;PCV2-ORF2编码氨基酸在抗体压力下发生正向选择,而疫苗免疫加速正向选择速度。氨基酸改变对疫苗有效性需要进一步研究。
【图文】：

示意图,示意图,蛋白质,基因组

1-1 PCV2 不同基因亚型 ORF1-ORF3 碱基定位及编码氨基酸ocation of ORF1-3 in different genotype and number of amino acCV2a(1768) PCV2b (1767) PCV2c (1767) 组mic蛋白质Protein基因组Genomic蛋白质Protein基因组Genomic蛋白质Proteintion aa NO. position aa NO. position aa NO95 314 51-995 314 51-995 314 1033 233 1733-1032 233 1734-1030 234 357 104 670-356 104 670-356 104 补连，表中各基因型使用的参考序列分别为 PCV2a：AF0553PCV2c：EU148504，PCV2d：HM038017。

国家,核酸,宿主,昆虫

4 年该团队又报道在野猪体内检测到 PCV2 核酸。此后在多个国家或地区的检测结猪自然感染 PCV2 现象比较普遍[93-95]，并且在多种动物体内可以检到 PCV2 核酸[96-10用于 PCV2 感染实验模型动物[101, 102]，但是 PCV2 诱导小鼠产生病理变化常常不稳定尽管在多种动物或蚊、蝇等昆虫体内 PCV2 核酸检测为阳性，但是病毒是否可在猪以哺乳动物或昆虫体内增殖，是否可导致相关疾病仍不十分清楚。跨越宿主障碍的现象毒均有报道[104, 105]，也是病毒进化的一种方式[106, 107]。有报道在儿童轮状病毒疫苗中CV2 核酸片段[108]，但是将疫苗接种于 PK15 细胞内并检测 PCV2 RNA 或相应蛋白质果为阴性，表明疫苗中的 PCV2 核酸片段不具有繁殖能力。目前还没有 PCV2 感染人内检测到 PCV2 核酸的报道，由于 PCV2 感染后主要导致宿主免疫系统紊乱，因此如感染跨越宿主障碍，在多种动物间广泛传播，，将会造成极大危害。V2 流行性和遗传进化PCV2 流行性和传播
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.651

【参考文献】