内质网应激在激素调控山羊子宫内膜上皮细胞功能中的作用及其机制研究

发布时间：2020-06-06 05:32

【摘要】：胚胎附植的第一个重要过程是建立子宫内膜上皮细胞和囊胚的联系。在反刍动物中,附植过程的顺利完成需要具有良好容受性的子宫内膜以及纤维状的孕体。研究表明,三分之二的妊娠失败是由于子宫容受性异常导致的,因此子宫内膜在妊娠维持和建立的过程中发挥十分重要的作用。在山羊胚胎植入期,子宫内膜会发生动态的改变,主要是受到母体来源的孕酮(P_4)、雌二醇(E_2)和孕体来源干扰素-Tau(IFN-τ)等激素的共同调控。孕酮和雌二醇可以刺激子宫内膜腔上皮细胞和浅层腺上皮细胞一些编码酶和分泌蛋白表达,干扰素-tau可以增加这些基因表达并参与调控孕体发育和附植。尽管在反刍动物的胚胎附植过程中已经确定了数万种基因和许多调控因子的表达,但激素对子宫内膜上皮细胞功能的调控机制并不完全清楚。内质网应激(ER stress)介导的未折叠蛋白反应(UPR)参与了众多生理学、病理学过程。研究发现UPR调控因子GRP78和内质网反应调控蛋白CREB募集因子(CREBRF)在小鼠附植位点表达升高,说明内质网应激及相关因子可能参与妊娠过程。本研究利用孕酮、雌二醇和干扰素-tau模拟山羊妊娠早期子宫内膜上皮细胞所处的激素环境。通过慢病毒干扰技术,运用Real time PCR、Western Blot、细胞免疫荧光染色、ELISA、流式细胞术和CCK-8等方法,研究了内质网应激和相关因子在激素调控山羊子宫内膜上皮细胞功能的分子机制。主要的试验结果如下:(1)孕酮、雌二醇和干扰素-tau共同作用山羊子宫内膜上皮细胞,促进促孕体伸长基因ISG15、CXCL10和RSAD2的表达,提高PGE_2:PGF_(2α)比例,增强胎盘滋养层细胞球粘附比率;并促进未折叠蛋白反应标志蛋白GRP78、CHOP、phosphoIRE1、Cleaved ATF6和phophoEIF2S1表达。(2)内质网应激激活剂毒胡萝卜素预处理增强未折叠蛋白反应标志蛋白GRP78、CHOP、phosphoIRE1、Cleaved ATF6和phophoEIF2S1表达,促进促孕体伸长基因ISG15、CXCL10和RSAD2的表达,上调PGE_2:PGF_(2α)比率,提高胎盘滋养层细胞球粘附比率;内质网应激抑制剂4苯基丁酸预处理抑制未折叠蛋白反应,但PGE_2:PGF_(2α)比率和细胞粘附水平并没有显著影响。(3)设计并构建了针对山羊ATF6干扰载体。使用倍比稀释的方法检测包装的shATF6病毒滴度为5-10?10~7 TU/mL,并在山羊子宫内膜上皮细胞上检测慢病毒干扰效率。抑制ATF6表达显著增强了促进促孕体伸长基因ISG15、CXCL10和RSAD2的表达,降低了PGE_2:PGF_(2α)比例,提高了胎盘滋养层细胞球粘附比率,增加了细胞粘附相关基因SPP1的表达。mTOR通路抑制剂雷帕霉素预处理shATF6 EECs,抑制了促进促孕体伸长基因CXCL10表达,提高PGE_2:PGF_(2α)比例,但细胞粘附能力没有受到显著影响。(4)孕酮、雌二醇和干扰素-tau共同作用山羊子宫内膜上皮细胞增强CREBRF和自噬标志蛋白LC3-II的表达。设计并构建了针对山羊CREBRF干扰载体。使用倍比稀释的方法检测包装的shCREBRF病毒滴度为5-10?10~7 TU/mL,并在山羊子宫内膜上皮细胞上检测慢病毒干扰效率。干扰CREBRF表达抑制CCNA2、CCNB1和CCND1的mRNA表达,使EECs阻滞在S期导致EECs增殖速率显著降低shCREBRF组PGE_2:PGF_(2α)比例和子宫容受性标志基因HOXA10和HOXA11表达低于对照组,并抑制滋养层细胞球粘附比率和SPP1表达。(5)雷帕霉素预处理shCREBRF EECs恢复了CREBRF表达抑制导致的PGE_2:PGF_(2α)比例降低,提高了HOXA10和HOXA11 mRNA水平表达,但是抑制mTOR通路对滋养层细胞球粘附比率和SPP1表达的影响不显著。使用氯喹抑制shCREBRF EECs晚期自噬过程降低了PGE_2:PGF_(2α)比例,抑制了HOXA10 mRNA水平表达,而氯喹预处理没有显著影响滋养层细胞球粘附比率,也没有发现对SPP1的转录和翻译产生显著改变。综上所述,本研究发现内质网应激介导的未折叠蛋白反应参与到了山羊早期妊娠期间激素对子宫内膜上皮细胞功能的调控,并部分揭示内质网应激相关因子ATF6和CREBRF对子宫内膜上皮细胞功能的分子调控机制,为进一步揭示山羊早期妊娠过程子宫内膜上皮细胞功能调控的分子机制提供新的理论依据。
【图文】：

第一章 反刍动物妊娠建立的研究进展子宫内膜容受性（附植窗口期），是在妊娠早期有限的一个阶段内，发生分子胞水平的生物学过程促进胚胎附植并建立妊娠。在附植窗口期，子宫内膜组结构和功能的变化，从而建立最佳的子宫环境帮助胚胎植入 (Qu et al., 2018)究表明，子宫内膜容受性的发育不良是导致妊娠失败的主要因素之一 (Liange)。在家畜动物的生物学研究发现，高比例的妊娠失败是由于子宫内膜容受性的 (SpencerandHansen,2015)。因此，子宫内膜容受性的健康与否，关系着动立，对于养殖效益的保证至关重要。反刍动物的子宫壁从功能上可以分为子宫内膜和子宫肌层。成熟的子宫内膜（LE）、腺上皮（GE）、基质、血管和免疫细胞组成。子宫内膜有两个特征明：腺阜和腺体间区域。腺阜区域是表面附植位点和胎盘形成位置，，包含腔上皮基质 (Wimsatt,1950,AmorosoandRowlands,1951,Zhaoetal.,2018)。反刍动物牛、山羊）妊娠的建立始于囊胚期，包括妊娠识别信号、附植和胎盘形成 (Imak, 2018)。

-2 绵羊子宫内膜溶黄体机制的激素调控和孕体在子宫环境抗溶黄体作用的图示(Spenc2015)igure 1-2 Schematic illustrating hormonal regulation of the endometrial luteolytic mechaniantiluteolytic effects of the conceptus on the ovine uterine endometrium(Spencer and Hansen, 20 孕酮调控子宫内膜功能和孕体伸长作用孕酮刺激和维持子宫内膜功能对于孕体发育、附植、胎盘形成和发育是pencer et al., 2016b)。在早期妊娠牛体内，孕酮浓度直接影响胚胎存活。度的增加促进了肉牛、奶牛和绵羊的孕体伸长，然而在黄体早期低剂量绵羊和牛的胚胎发育迟缓 (Lonerganetal.,2016)。在早期妊娠阶段额外补胚胎成活的作用尚不确定，很有可能对于存在缺陷的高产奶牛胚胎并没在牛和绵羊上，已经证实了妊娠后提高孕酮浓度有利于孕体伸长。研究 mg 孕酮从妊娠第 1 天开始处理，连续处理四天，增加了外周血浆孕酮浓
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S827

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本文编号：2699233