猪肌内脂肪差异性沉积关键基因鉴定及AQP3的功能研究
发布时间：2020-06-06 05:41
【摘要】：肌内脂肪含量是影响肉质风味的关键因素,猪不同部位肌肉组织的肌内脂肪含量存在差异,从而影响了不同部位肉质的口感,而有关猪肌内脂肪在不同部位差异性沉积的调控机制尚不明确。转录组测序能够揭示生物在某种特定功能状态下几乎所有转录本信息,在动物育种工作中的应用越来越深入。本研究通过构建不同分化时期(分化0天、2天和8天)分离自猪背最长肌(Ld)和半腱肌(Sd)的肌内脂肪细胞的cDNA文库,利用RNA-seq技术进行测序,对测序数据进行质控过滤后,筛选出差异基因,并基于差异基因进行GO功能和Pathway显著性富集分析等,揭示影响猪肌内脂肪差异性沉积的调控机制,为猪遗传育种提供理论基础。本研究通过测序发现了水/甘油通道蛋白成员AQP3在猪Ld肌内脂肪中表达显著高于Sd,但目前关于AQP3对肌内脂肪沉积的作用并不明确。为验证AQP3对猪肌内脂肪沉积的作用,本研究首先利用实时定量PCR检测了AQP3在猪不同部位的组织表达谱以及在肌内脂肪细胞分化过程中的表达规律,之后采用RNAi技术干扰AQP3后,用实时定量PCR、WB、油红O、Bodipy染色及CCK-8、EdU染色等多种方法探索其对肌内脂肪细胞增殖和分化的影响。上述研究获得以下主要结果:1.分离自猪背最长肌和半腱肌的肌内脂肪细胞,在分化0、2、8天收集RNA进行测序,筛选出的差异基因数量分别为186、819和548个,其中半腱肌相较于背最长肌而言,上调基因分别有139、284及339个,下调基因分别有47、535及209个。2.对筛选到的差异基因进行GO功能富集分析,发现肌内脂肪沉积水平较高的部位(即背最长肌)富集度较高的生物学过程包括对养分的应答、长链脂肪酸转运、对糖皮质激素的应答、脂质储存、甘油三酯代谢以及脂肪细胞分化的正向调节等方面;在Pathway富集分析中,在背最长肌中上调的信号通路主要有PPAR信号通路、脂肪酸代谢、脂肪酸延伸、丙酮酸代谢、三羧酸循环和不饱和脂肪酸的生物合成等,即与半腱肌相比,脂质代谢相关通路在背最长肌肌内脂肪细胞中显著富集。3.测序数据及qPCR验证结果均显示AQP3在背最长肌中的表达显著高于半腱肌;AQP3在猪不同组织中广泛表达,其中在脂肪组织中表达量最高,肾脏次之;AQP3在肌内脂肪细胞分化过程中呈现先上升后下降的趋势,于分化第4天达到高峰值。4.干扰AQP3显著降低了成脂标志基因PPARγ、aP2和脂质合成相关基因ACACA、SCD、DGAT2、mGPAT、ELOVL6和FASN的表达量,显著抑制了脂滴的形成,说明干扰AQP3能够抑制猪肌内脂肪细胞的分化。5.干扰AQP3显著降低了细胞周期蛋白Cyclin B、Cyclin D、Cyclin E及其依赖性激酶CDK4的表达,并且抑制了细胞活性,说明干扰AQP3能够抑制猪肌内脂肪细胞的增殖。综上,本研究通过RNA-seq筛选出背最长肌和半腱肌肌内脂肪的差异基因,GO和KEGG pathway分析显示脂质储存、脂肪酸代谢等通路在成脂能力较强的背最长肌肌内脂肪中显著富集。此外,本研究发现AQP3在背最长肌肌内脂肪中高表达,干扰AQP3显著抑制了猪肌内脂肪细胞的分化和增殖,提示AQP3可能与不同部位肌内脂肪的沉脂能力有关。本研究全面解析了不同部位的肌内脂肪差异性沉积的分子基础,并明确了AQP3对肌内脂肪细胞成脂的促进作用,为完善猪肌内脂肪差异性沉积的调控机制提供了理论基础。
【图文】：
板衍生生长因子受体α（PDGFRα）和干细胞抗原（Sca-1）均是成脂有 PDGFRα+/ CD45-和 Sca-1+/ CD34+/ CD45 特点的细胞就是具有高成Gulyaeva et al. 2018; Iwayama et al. 2015）。在脂肪组织中约有 15%到体脂肪细胞自基质血管细胞分化形成，这些细胞存在于脂肪血管中uel-De Mouzon S 2011; Tan et al. 2011）。如图 1-1 所示，间充质干细胞发育，受多种因素影响，能够分化为成骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞组织等（Hu et al. 2018; Gesta et al. 2007）。
图1-2 RNA-seq测序步骤Fig 1-2 A typical RNA-seq experiment生物信息学分析生物信息学分析流程如图 1-3 所示，由 Illumina HiSeq raw reads，其中包含了测序加上的接头序列和一些低质控（Quality Control, QC），以保证测序数据能够达到要将过滤获得的 clean reads 比对到参考序列，判断比对结of alignment）后，进行基因和转录本定量分析、基因结可变剪切等相关分析，并基于定量结果筛选出的差异logy）功能和 Pathway 显著性富集分析等更深入的数据. 2018; Raghavachari et al. 2018; Peng et al. 2012）。成功案例其强大的功能，目前已应用于基础研究、医学诊断和生不菲的成绩。Zhang 等通过水稻转录组测序项目发现 R的低丰度基因（Zhang et al. 2010）。Ren 等通过对来
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S828
本文编号：2699244
【图文】：
板衍生生长因子受体α（PDGFRα）和干细胞抗原（Sca-1）均是成脂有 PDGFRα+/ CD45-和 Sca-1+/ CD34+/ CD45 特点的细胞就是具有高成Gulyaeva et al. 2018; Iwayama et al. 2015）。在脂肪组织中约有 15%到体脂肪细胞自基质血管细胞分化形成，这些细胞存在于脂肪血管中uel-De Mouzon S 2011; Tan et al. 2011）。如图 1-1 所示，间充质干细胞发育，受多种因素影响，能够分化为成骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞组织等（Hu et al. 2018; Gesta et al. 2007）。
图1-2 RNA-seq测序步骤Fig 1-2 A typical RNA-seq experiment生物信息学分析生物信息学分析流程如图 1-3 所示，由 Illumina HiSeq raw reads，其中包含了测序加上的接头序列和一些低质控（Quality Control, QC），以保证测序数据能够达到要将过滤获得的 clean reads 比对到参考序列，判断比对结of alignment）后，进行基因和转录本定量分析、基因结可变剪切等相关分析，并基于定量结果筛选出的差异logy）功能和 Pathway 显著性富集分析等更深入的数据. 2018; Raghavachari et al. 2018; Peng et al. 2012）。成功案例其强大的功能，目前已应用于基础研究、医学诊断和生不菲的成绩。Zhang 等通过水稻转录组测序项目发现 R的低丰度基因（Zhang et al. 2010）。Ren 等通过对来
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S828
【参考文献】
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1 陈粉粉;猪肌内脂肪细胞分化过程miRNA的鉴定及miR-34c的功能研究[D];西北农林科技大学;2017年
，本文编号：2699244
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