表达MERS-CoV S1蛋白重组狂犬病病毒的纯化与实验免疫研究

发布时间：2020-06-06 10:15

【摘要】：中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome,MERS)是由中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)所引起的一种高度传染性人兽共患病。自2012年首例MERS患者病例被确诊以来,因其在全球范围内传播范围广、致死率高而受到世界卫生组织(World Health Organization,WHO)的广泛关注。2015年我国报道出现的首例输入性MERS患者,这无疑为我国的MERS防控增加了挑战,也敲响了警钟。流行病学调查表明,单峰驼是MERS-CoV的重要中间宿主,人可通过与病畜直接或间接接触感染MERS-CoV。因此,加强针对MERS的新型疫苗研究,对单峰驼等动物宿主进行免疫源头免疫是MERS防控的关键。近年来,随着疫苗监管部门对疫苗质量、安全性要求的逐步升级,经简单粗放生产的疫苗已不能满足市场需求,必须提高疫苗纯度,加强对疫苗的纯化工艺探索研究。密度梯度离心法、沉淀法是病毒分离纯化工艺的经典方法,缺点是杂质去除效果有限,疫苗纯度低,安全性差,副作用大,无法线性放大应用于规模化生产。而一些新的分离纯化技术如膜过滤、层析等因自动化程度高、操作简便、回收率高而受到广泛关注。基于此,本研究旨在建立表达MERS-CoV S1蛋白重组狂犬病病毒rSRV9-MERS_(S1)的悬浮培养工艺,同时研究其浓缩纯化方法,并且通过动物试验评价纯化病毒的免疫效果,为MERS新型疫苗的研究奠定基础。1、rSRV9-MERS_(S1)重组病毒悬浮培养的初步研究通过比较不同感染复数(Multiplicity of infection,MOI)下接毒后,BHK 21细胞的生长曲线和病毒滴度变化来确定最佳的MOI。同时对病毒的收获时间、收获次数等参数进行优化来确定病毒的悬浮培养条件。结果显示:当MOI=0.05时,以2×10~6个/mL的细胞密度作为工作细胞密度,接毒后48 h病毒滴度可达2×10~8 TCID_(50)/mL。离心收取细胞上清,用相同体积的新鲜培养液均匀重悬细胞沉淀,继续培养48 h,病毒滴度可达2×10~9 TCID_(50)/mL。2、rSRV9-MERS_(S1)重组病毒的浓缩纯化方法研究将收获的病毒培养液灭活后,分别通过三种方法(醋酸锌沉淀+Sepharose 4FF凝胶过滤层析、500 KD中空纤维超滤柱+Sepharose 4FF凝胶过滤层析、500 KD中空纤维超滤柱+Cellufine~TMM Sulfate亲和层析)进行纯化,通过比较最终筛选出一种温和、目的蛋白回收率高、纯度高的纯化方法。结果显示:500 KD中空纤维超滤柱+Sepharose4FF凝胶过滤层析回收的抗原含量最高,50 mL重组病毒原液经纯化后可得到1.82 mg蛋白,杂蛋白去除率可高达97.02%;电镜下观察可见到纯化的病毒粒子具有较好的形态。结合生产成本等方面综合考虑,最终确定选用此种方法进行病毒的浓缩纯化。3、rSRV9-MERS_(S1)纯化病毒的实验免疫研究通过500 KD中空纤维超滤柱+Sepharose 4FF凝胶过滤层析法来制备纯化的病毒。同时将不同剂量(2μg、10μg、50μg)的纯化病毒及未纯化病毒免疫小鼠,通过测定抗MERS-CoV IgG抗体效价消长规律、抗MERS-CoV中和抗体水平等综合评价纯化病毒的免疫原性及免疫效果。结果显示:在抗MERS-CoV IgG抗体效价及抗MERS-CoV中和抗体水平上,不同剂量组呈现剂量依赖性效应,且抗体水平随着免疫次数的增加而升高;纯化的病毒具有良好的免疫原性,且可诱导小鼠产生良好的体液免疫应答。与未纯化病毒相比,纯化病毒可诱导小鼠较早产生高水平的体液免疫应答。
【图文】：

生长变化,细胞密度,悬浮细胞培养,学位论文

）学位论文悬起来，继续置于悬浮细胞培养箱中培养 2 测定，剩余部分-80℃冻存。细胞生长变化细胞经不同 MOI 接种后，细胞生长曲线的情=0.1 下细胞生长曲线基本一致。BHK 21 悬浮高峰，细胞密度为 5~6×106个/mL，显微镜下死亡细胞，48 h 后细胞密度开始下降，死亡106个/mL 左右。

亲和层析法,图谱,纯化抗原

结果纯化结果如表 2-1 所示。100 mL 病毒滴度为 2×108T经过醋酸锌沉淀+ Sepharose 4FF 凝胶过滤层析纯化，5 mg/mL 的纯化抗原。相同滴度的 100 mL 重组病毒原滤柱浓缩为 5 mL。取 2.5 mL（相当于 50 mL 病毒原液胶过滤层析纯化，收获 1.5 mL 蛋白浓度为 1.21 mg/m 经过 CellufineTMSulfate 亲和层析纯化，获得 1.5 mL 蛋化抗原，纯化抗原含量是 500 KD 中空纤维超滤柱+S析纯化方法的二分之一。病毒纯化过程中，Sepharose 蛋白峰，第 1 峰为 rSRV9-MERSS1峰，，第 2 峰为杂蛋ate 亲和层析法纯化病毒的峰值图谱（见图 2-1），洗脱峰。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65

【参考文献】