miR-181a-5p靶基因预测及其在鹅颗粒细胞增殖凋亡中的作用研究

发布时间：2020-06-06 13:25

【摘要】：miRNA参与卵巢类固醇激素合成与分泌、细胞增殖与凋亡等多种生理过程,对卵泡发育具有重要的调控作用。课题组前期研究发现,miR-181a-5p在鹅卵泡颗粒层中高表达,可能参与颗粒细胞的增殖凋亡过程,有关miR-181a-5p在禽类颗粒细胞中的功能研究尚未见报道。因此,本研究利用生物信息学方法预测miR-181a-5p可能的靶基因及信号通路,在细胞水平上进一步探索miR-181a-5p对鹅颗粒细胞增殖凋亡的影响及其调控机制。其主要结果如下:(1)生物信息学分析表明,miR-181a-5p可能通过SIRT1、BCL2、CDKN1B、PTEN等靶基因参与FOXO信号通路调控颗粒细胞增殖凋亡过程。(2)qPCR结果分析表明,miR-181a-5p在2-4 mm表达最高,4-6 mm表达最低,之后在4-6 mm、8-10 mm、F5这三个阶段均呈现显著上升趋势。聚类分析发现,miR-181a-5p与其靶基因的表达模式在8-10 mm、F5阶段发生了较大的变化,而与细胞增殖凋亡相关基因SIRT1、BCL2、CDKN1B、PTEN聚为一类,表明miR-181a-5p及其靶基因可能参与颗粒细胞增殖凋亡过程的调控。(3)通过浓度梯度转染mimic和inhibitor发现,在颗粒细胞中,mimic和inhibitor的最佳转染浓度分别为50 nM和120 nM。MTT检测结果显示,转染mimic能显著降低细胞活力(P0.05),转染inhibitor能使细胞活力增强(P0.05)。(4)在过表达miR-181a-5p后,细胞增殖标志基因PCNA和抗凋亡基因BCL2的表达均显著下降(P0.05),而细胞凋亡相关基因TP53、BAX、CASP3表达显著上升(P0.05)。在抑制miR-181a-5p后,呈现出相反的结果。表明miR-181a-5p具有抑制颗粒细胞增殖、促进凋亡的作用。(5)通过双荧光素酶报告系统检测发现,共转染野生型质粒和mimic时,荧光素酶活性显著下降(P0.05),当结合位点被突变后,荧光素酶活性显著上升(P0.05),表明miR-181a-5p可靶向结合SIRT1-3′UTR,抑制其mRNA水平的表达。(6)过表达miR-181a-5p后,FOXO信号通路的核心基因FOXO1及下游基因CDKN1A、CDKN1B的表达量均出现显著上升(P0.05),而细胞存活调节因子AKT1表达量显著下降。表明miR-181a-5p可能通过靶基因SIRT1参与FOXO信号通路引起颗粒细胞凋亡。综上,miR-181a-5p可通过介导SIRT1参与FOXO信号通路调控颗粒细胞的增殖凋亡。本研究为深入探究miR-181a-5p在鹅颗粒细胞中的调控机制奠定了理论基础。
【图文】：

图 1-1 miRNA 的生物合成[9]Fig 1-1 Biogenesis of microRNAsA 的作用机制对其靶基因的调控作用主要是负调控，但是也存在正碱基被称为种子序列，miRNA 主要通过其种子序列以靶基因的 3′UTR 区域，进而通过对靶基因 mRNA 的下调靶基因的表达，最终实现对其靶基因转录后水平要取决于 miRNA 与其靶基因 mRNA 的互补程度。结合多数不是完全的碱基互补配对，通常只要保证其能实现对靶基因的调控[12]。在动物中，miRNA 沉默主切割的方式影响靶基因 mRNA 的稳定性[13]。miR式通常在植物中较为常见，这种结合方式可导致靶基年来研究表明，miRNA 结合的区域还可能是基因的

图 1-2 miRNA 参与卵泡的发育过程[19]Fig 1-2 MicroRNAinvolved in regulation of ovarian follicle developmentiRNA 在颗粒细胞增殖凋亡中的作用表明，miRNA 对颗粒细胞的增殖、分化、凋亡均具有重要的调控的增殖分化状况直接影响卵泡的生长发育。miRNA 在颗粒细胞中以促进颗粒细胞的增殖又可以抑制颗粒细胞的增殖（表 1-1）。JimiR-93 可以直接靶向 CDKN1A 启动颗粒细胞增殖和细胞周期 可通过靶向抑制凋亡信号调节酶 ASK1 的表达，增加颗粒细胞的生[31]发现 miR-19b 靶向抑制 IGF-1 的表达，，而在抑制 miR-19b 后可以殖。Yin 等[32]研究表明，在小鼠颗粒细胞中，过表达 miR-320 可SF-1 的表达，进而抑制颗粒细胞的增殖，而 miR-383 则可启动 mi抑制作用能够被进一步增强。Yan 等[33]研究发现，miR-145 能够直IB 的表达，导致颗粒细胞的增殖被抑制。miR-143 可通过靶向作用
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S835

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本文编号：2699742