C型钠肽促进牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的作用及其机制研究

发布时间：2020-06-06 19:53

【摘要】：哺乳动物卵母细胞的减数分裂进程起始于胎儿发育时期所形成的初级卵母细胞,并被阻滞在第一次减数分裂的双线期,该阻滞期可持续数年甚至数十年之久。这种阻滞于第一次减数分裂双线期的初级卵母细胞,与周围的前颗粒细胞共同组成原始卵泡。哺乳动物性成熟后,卵巢中的原始卵泡逐步开始发育成熟或闭锁退化,其中在发育成熟的卵泡中的初级卵母细胞由未生长状态生长为充分生长初级卵母细胞,充分生长初级卵母细胞在排卵前促性腺激素峰的作用下,恢复减数分裂进程、完成第一次减数分裂,形成次级卵母细胞。紧接着,次级卵母细胞进入第二次减数分裂进程,并再次被阻滞在第二次减数分裂中期,直至受精。卵母细胞体外成熟研究结果表明,卵母细胞一旦脱离卵泡内减数分裂阻滞的生理环境,就会自发恢复减数分裂,而此时初级卵母细胞可能尚未达到胞质的充分成熟,过早恢复并完成减数分裂,不利于支持卵母细胞后续发育。在体外培养条件下,应用蛋白质合成抑制剂、蛋白磷酸化抑制剂和环化腺苷酸类似物等物质均有可能抑制卵母细胞减数分裂的恢复,避免卵母细胞的过早核成熟,使核成熟和胞质成熟同步化。但是,上述非特异性抑制剂抑制卵母细胞减数分裂过早恢复的同时,会影响卵母细胞的细胞结构和后续发育能力,最终其囊胚形成率与未经抑制剂处理的卵母细胞相似,并不能有效提高卵母细胞的利用效率。C型钠钛(C-type natriuretic peptide)为钠尿肽家族成员之一,于1990年在猪的大脑中得以分离纯化。最近的研究表明,CNP是小鼠卵泡中天然存在的、能够维持卵母细胞减数分裂阻滞的关键物质,卵丘细胞钠肽受体2(Natriuretic peptide receptor 2,NPR2)是CNP在卵泡的特异性受体。在猪上的研究结果也表明,CNP能够维持卵母细胞的减数分裂阻滞状态,使卵母细胞核成熟和胞质成熟同步化,进而提高卵母细胞的成熟率和胚胎发育能力。本实验室之前的研究结果显示,CNP能够促进牛卵母细胞的体外成熟和孤雌激活胚胎的囊胚形成率,但CNP促进牛卵母细胞发育能力的分子机制还不清楚。本研究在检测牛不同发育阶段卵泡中Npr2 mRNA表达的基础上,结合雌激素对Npr2mRNA表达的影响,利用牛卵母细胞和孤雌激活胚胎的体外成熟培养体系,研究CNP对牛卵母细胞减数分裂进程和发育能力的作用和机制。1.利用自制针梳分离法分离屠宰场来源牛卵巢中不同发育阶段的腔前卵泡。分离结果显示,分离得到的直径50~100μm的腔前卵泡数量最多,直径为100~200μm的卵泡数量次之,直径为200μm以上的卵泡数量最少。2.利用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和凝胶电泳技术,以及实时定量PCR(quantificational real-time PCR,qRT-PCR)技术检测牛卵巢内不同发育阶段卵泡中Npr2 mRNA的表达情况。研究结果显示,在牛原始卵泡中未检测到Npr2 mRNA的表达;在初级卵泡、次级卵泡和不同直径大小的有腔卵泡中均检测到Npr2 mRNA的表达。qRT-PCR结果显示,Npr2 mRNA的表达水平随卵泡发育而逐渐升高。3.利用常规PCR和凝胶电泳技术,分别对牛的有腔卵泡内壁颗粒细胞、卵丘细胞和卵母细胞中Npr2 mRNA的表达情况进行检测。结果表明,在卵泡壁颗粒细胞、卵丘细胞和卵母细胞中均检测到Npr2 mRNA的表达。4.利用卵母细胞体外培养和qRT-PCR技术研究雌激素对体外培养的牛卵丘-卵母细胞(cumulus-oocyte complexs,COCs)Npr2 mRNA表达的影响。研究结果显示,在卵母细胞体外成熟培养过程中,对照培养的COCs中Npr2 mRNA表达量随着体外培养的进行逐渐下降;而成熟培养液中分别添加10 ng/mL,100 ng/mL和1000 ng/mL17β-雌二醇(17 beta estradiol,17β-E2)时,均能不同程度地延缓Npr2 mRNA表达水平的下降,其中100 ng/mL17β-E2培养组能够显著维持COCs中Npr2 mRNA的表达。5.牛COCs在添加20 nmol/L,40 nmol/L,80 nmol/L和160 nmol/L CNP的培养液中分别培养4 h和6 h后,检测卵母细胞核所处的减数分裂阶段。结果显示,CNP未显著影响牛卵母细胞GVBD的发生。6.牛COCs在添加20 nmol/L CNP的成熟培养液中培养12 h,之后转入常规培养液中继续培养至24 h,能显著提高牛卵母细胞体外成熟率和孤雌胚胎的发育率(P0.05)。7.利用qRT-PCR技术对孤雌激活囊胚发育相关基因进行检测,结果显示,CNP的添加能够显著提高H19和Bmp15的表达水平(P0.05),而Xist和Slc16a2的表达量在两组间差异不显著(P0.05)。8.利用ELISA技术检测牛COCs中环化鸟苷酸(cyclic guanylic monophosphate,c GMP)浓度。结果显示,牛COCs中c GMP浓度随体外培养时间的延长而不断降低,而CNP能够暂时性维持牛COCs中cGMP浓度。上述研究结果表明,牛卵巢中不同发育阶段卵泡Npr2 mRNA表达水平存在明显差异;牛有腔卵泡内壁颗粒细胞、卵丘细胞和卵母细胞中均有Npr2 mRNA表达;雌激素可相对减缓体外培养COCs内Npr2 mRNA表达水平的下降;CNP对体外成熟培养牛卵母细胞减数分裂进程无显著影响,但能够暂时性维持COCs中cGMP浓度,进而为卵母细胞发育提供适宜浓度的环化腺苷酸(cyclic adenoson monophosphate,cAMP),从而显著提高牛卵母细胞体外成熟率和孤雌胚胎的发育率。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S814

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