猪源肠外致病性大肠杆菌PCN033六型分泌系统VgrG蛋白的功能及其引发炎症的机制研究

发布时间：2020-06-06 20:01

【摘要】：肠外致病性大肠杆菌(ExPEC),是一类具有特殊毒力因子的大肠杆菌,可导致人和动物除肠道以外多种器官组织的病变。其中,猪源肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)给养猪业带来了巨大的经济损失,并对公共健康构成威胁。六型分泌系统(T6SS)在细菌的竞争和致病过程中扮演重要角色,T6SS基因簇普遍存在于革兰氏阴性菌变形菌门中,VgrG是T6SS实现功能的核心组件之一。炎症是机体应对外来感染的急性反应,有报道显示T6SS在细菌感染并引发炎症的过程中发挥了重要作用。本实验室对菌株PCN033全基因组测序,发现T6SS基因簇位于菌株基因组中,并且含有4个假定的vgrG基因,两个位于基因簇内部(vgrG1和0248),两个位于基因簇外部(vgrG2和1588)。本研究探究了四个假定的vgrG基因在T6SS发挥功能中的作用,同时初步探讨了T6SS在PCN033参与炎症反应过程中的作用,取得主要结果如下:1.猪源肠外致病性大肠杆菌中T6SS基因簇内外的vgrG基因功能的研究在猪源肠外致病性大肠杆菌PCN033中共鉴定出四个假定VgrG蛋白,其中VgrG1和0248位于T6SS基因簇内,而VgrG2和1588位于T6SS基因簇外,我们首先探讨了基因簇内外VgrG的功能。经抗菌活性、细胞互作、小鼠致病性及全血杀伤实验证实PCN033中四个VgrG中,基因簇内的VgrG1和/或0248在PCN033的抗菌,致病过程中发挥主要功能,而位于基因簇外的VgrG2和1588在PCN033的抗菌、细胞互作及致病过程中则无明显作用。2.VgrG1在T6SS参与PCN033的抗菌致病过程中起主要作用经进一步分析保守结构域发现:0247(VgrG1)和1587(VgrG2)含有完整的VgrG结构域,且二者之间只有一个氨基酸不同,而0248和1588虽然与VgrG具有同源序列却不含有保守的gp27/gp5结构域,且二者序列完全相同。进一步实验发现:PCN033中四个假定VgrG中,仅基因簇内的VgrG1参与PCN033的抗菌及致病过程。推测0248和1588因不具有完整的VgrG保守域而不发挥功能;VgrG2与VgrG1一个碱基的差异并不影响VgrG2的功能,二者功能不同的原因最有可能归因于它们在PCN033中表达量差异所致。3.T6SS可激活NLRP3炎性体促进PCN033的炎症反应炎症是机体对外界刺激的一种防御反应。通常情况下炎症是有益的,但是不当或严重的炎症反应是有害的。为了进一步探讨T6SS在PCN033发病机制中的作用,我们使用PCN033及T6SS缺失株进行了炎症激活检测。通过探讨T6SS在PCN033引起炎症反应过程中的作用,我们发现:T6SS缺失后PCN033引起的炎性水平显著下降,即T6SS参与PCN033引起的炎性反应过程;进一步实验发现:T6SS可能通过激活NLRP3炎性小体促进PCN033的炎症反应。综上所述:PCN033中含有四个假定的VgrG家族蛋白,通过一系列实验表明,只有基因簇内的VgrG1参与PCN033的抗菌能力,并促进其对宿主细胞的黏附和侵袭,增强其在宿主中的致病性。进一步实验证明T6SS可通过激活NLRP3炎性小体参与PCN033的炎症反应过程。本研究为深入理解T6SS的作用机制及PCN033的致病机制奠定了基础。
【图文】：

T6SS 才正式在铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和霍乱弧菌（Vlerae）中被提出（Pukatzki et al 2006; Mougous et al 2006）。T6SS 从发现到被研究人员们关注。截至 2019 年 06 月 20 日，在 NCBI 数据库中以“T6SS”搜索到的文献数达 617 篇。2015 年，Li 等人建立了细菌 T6SS 相关的数ReT6。该数据库中收录了不同种属的 T6SS 信息，不仅收录了 T6SS 的结构信息，还包含了 T6SS 相关的免疫因子及效应因子的有关信息。.1.2 六型分泌系统结构组成T6SS 基因簇通常包括 15-25 个基因（Basler et al 2012; Leiman et al 2009）因主要有：hcp（hemolysin-coregulated protein）、vgrG（valine-glycine repeat pr、clpV、icmF、dotU 等（Cascales 2008）。这些 T6SS 的保守成分组装成膜复合管道，，穿刺针/尖刺，尾管/鞘和基板，如图 1-5 所示（Cascales 2008; Cascalebillau 2012）。

料、质粒与细胞 PCN033 野生株，D 群系，血清型 O11，K2 荚膜型场病猪脑组织，经小鼠模型感染实验和本动物感染基因组测序，由本实验室保存。 K12 菌株 W3110 由武汉病毒所邓教宇教授惠赠，本粒pRE112（oriT oriV asd CmrSacB）及其宿主菌大肠uA21 lacY1 glnV44 asdA4 recA1 RP4 2-Tc∷Mu[λpioy Curtiss Ⅲ教授惠赠，本实验室保存，其结构如图5α、E.coli/BL21（DE3）感受态细胞购自北京全式使用的部分载体的结构示意图如下：
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.612

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本文编号：2700187