N-MDRV广东株致病性、序列分析及σB蛋白的原核表达

发布时间：2020-06-07 00:05

【摘要】：近年来在福建、广东、浙江等地皆有新致病型番鸭呼肠孤病毒(New pathotype of muscovy duck reovirus,N-MDRV)病的报道;该病俗称“番鸭新肝病”,主要剖检病变为肝脏不规则坏死、出血;患病鸭日龄愈小,病死率愈高,给养鸭业造成严重的经济损失。目前,有关广东省N-MDRV的致病性及遗传进化分析方面的研究较少。σB蛋白作为N-MDRV主要的外衣壳蛋白,有良好的免疫原性和反应原性。本研究旨在对广东省N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13流行毒株的致病性、全基因序列进行比较分析,同时对N-MDRV/DH13株σB蛋白的原核高效表达进行初步研究。本研究将N-MDRV/SH12、N-MDRV/DH13株均以10~4.00.00 ELD_(50)的剂量经眼鼻、肌注、爪垫途径分别感染1日龄雏番鸭,N-MDRV/SH12攻毒组死亡率在10%~20%之间,N-MDRV/DH13攻毒组死亡率均为30%。为进一步研究N-MDRV对雏番鸭和雏鸡的致病性差异,将N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株分别肌注感染1日龄雏番鸭和雏鸡。结果显示:2株病毒感染雏番鸭3 d后饮食能力下降,有轻微腹泻;感染7 d后临床症状明显,患病鸭剖检病变为肝脏大范围坏死、出血,脾脏肿大、坏死,法氏囊萎缩(N-MDRV/SH12组)或坏死出血(N-MDRV/DH13组),N-MDRV/SH12组感染14 d后雏番鸭体重显著下降(P0.01)。而N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株感染雏鸡,均不能致死,部分患病鸡感染3 d后饮食能力下降,被毛疏松,N-MDRV/SH12组感染14 d后雏鸡体重显著下降(P0.05);患病鸡剖检可见肝脏、脾脏病变类似于“番鸭新肝病”,但法氏囊眼观无明显病变。病理组织切片显示:雏番鸭感染7 d后,肝脏、脾脏、法氏囊坏死灶内有大量红细胞和单核细胞浸润,脾脏、法氏囊的淋巴细胞坏死、减少,感染后期脾脏可见肉芽肿结构。以上结果表明,N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株感染雏番鸭和雏鸡的致病性不同,但均可感染雏番鸭和雏鸡的肝脏、脾脏。为研究N-MDRV不同致病性毒株基因组结构特点及遗传进化关系,利用RT-PCR方法对N-MDRV/SH12、N-MDRV/DH13株全基因组序列进行扩增和测序。结果显示:2株病毒间各基因片段核苷酸和氨基酸序列相似性较高,分别为97.1%~99.8%和97.5%~100.0%;与GenBank中N-MDRV、DRV、GRV参考毒株核苷酸和氨基酸序列相似性亦较高,分别为86.3%~99.6%和93.3%~100%。σC蛋白基因序列相似性及遗传进化树的分析结果均显示,相邻地区的基因2型毒株其遗传关系更近。σA、σB、σNS、μA蛋白变异位点有一定规律性;有共同变异位点的病毒株,其蛋白基因序列相似性和遗传进化树分析的结果均显示,该类病毒株遗传关系更近。除μB蛋白基因外,其他9个蛋白基因片段序列相似性和遗传进化分析结果均显示,水禽源呼肠孤病毒间亲缘关系较近,与鸡源ARV亲缘关系较远;经SimPlot重组软件分析这可能是基因2型的μB蛋白基因片段来源于ARV和ARV-Md基因重组的结果。以上结果表明,N-MDRV/SH12、N-MDRV/DH13株均属于水禽呼肠孤病毒基因2型,且两者遗传演化关系较同分支的其他基因2型毒株更为相近。病毒株各蛋白氨基酸位点差异有可能会导致病毒致病性的不同。比较2株病毒和10株基因2型参考毒株各蛋白氨基酸变异位点及其潜在糖基化位点发现,除了λB蛋白外,其他蛋白的潜在糖基化位点因氨基酸位点变异有所变化;σNS蛋白109、270位点的变异使得N-MDRV/SH12、N-MDRV/DH13株蛋白在pH 7.0时带不同电荷;2株病毒σC、σB蛋白单个氨基酸位点的变异对蛋白预测抗原表位几乎没有影响,但蛋白抗原表位不局限于疏水性。以上结果仅对N-MDRV各蛋白氨基酸位点进行了初步分析,其位点的变异是否与毒株致病性相关,还需得到毒株蛋白进一步验证。为探究N-MDRV中与致病性相关的σB蛋白原核高效表达,本研究选择优化致病性较强的N-MDRV/DH13σB蛋白基因密码子,构建的pET-32a(+)-σB-BL21(DE3)原核表达重组菌经IPTG诱导后表达出σB蛋白。在最佳的诱导条件下获得σB蛋白的表达量占细菌总蛋白量的32.3%,经SDS-PAGE分析发现σB重组蛋白主要以包涵体形式存在。再经Ni~(2+)柱纯化获得高纯度可溶性的σB蛋白,Western blotting分析显示该蛋白具良好的反应原性。本研究为N-MDRVσB蛋白基因疫苗、诊断试剂盒的研制奠定基础。
【图文】：

图 3-2 2 株 N-MDRV 不同途径攻毒组的生存曲线图表 3-1 雏番鸭感染 N-MDRV 14d 后主要组织病理变化器官 病理变化SH12 雏番鸭攻毒组（患鸭数/存活数）DH13 雏番鸭攻毒组（患鸭数/存活数）

雏番鸭主要组织器官病理变化
【学位授予单位】：佛山科学技术学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

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1 梅敏敏;N-MDRV广东株致病性、序列分析及σB蛋白的原核表达[D];佛山科学技术学院;2018年

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本文编号：2700490