鸡、鸭、鹅和猪黑素皮质素受体5和突变体的真核表达及药理学特性初探

发布时间：2020-06-07 21:07

【摘要】：黑素皮质素受体5(The melanocortin-5 receptor,MC5R)属于G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors,GPCRs)。该受体被证实在脂质生成、骨骼肌脂肪酸氧化和脂肪细胞代谢等过程中发挥重要作用。然而,目前有关MC5R的研究主要集中在人和小鼠上,但对于禽类以及猪的研究较少。为了深入了解鸡、鸭、鹅和猪MC5R(c/d/g/pMC5R)的功能,解析受体和配体在相互作用过程中细胞信号通路变化,同时为后期的药物筛选或遗传育种等提供理论基础,我们克隆了四种动物的MC5R基因,构建了真核表达载体。根据前人研究对MC5R与配体结合至关重要的氨基酸位点进行了单点突变,得到了各3个突变体:c/d/gMC5R-D119A/F254A/H257A、pMC5R-D204A/F339A/H342A。将四种动物的 MC5R野生型和突变体分别转染人胚胎肾细胞(Human Embryonic Kidney T cells,HEK293T)中,利用双荧光素酶报告基因法和Western Blot测定配体作用下MC5R野生型和突变体胞内第二信使环磷酸腺苷水平(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)与细胞外调节蛋白激酶1/2(Extracellularregulatedproteinkinases l/2,ERK1/2)磷酸化水平的变化规律,以阐明体外表达的MC5R野生型与突变体对不同配体的反应活性及信号通路的差异。结果如下:1.设计引物,扩增出四种动物MC5R的编码区序列,连接至pcDNA3.1(+)真核表达载体得到pcDNA3.1(+)-c/d/g/pMC5R,利用定点突变技术构建了各3个突变体。最终得到4种野生型和各3种突变体,共16个真核表达载体。2.将四种动物的MC5R野生型和突变体真核表达载体分别与萤火虫和海肾荧光素酶报告质粒转染至HEK293T中,检测胞内基础cAMP水平。结果显示,c/d/gMC5R-F254A和pMC5R-H342A的基础活性显著升高,其他突变体与野生型的基础活性相差不大。用不同浓度的不同配体刺激,检测胞内cAMP水平的变化。结果显示,c/d/gMC5R-D119A和pMC5R-D204A突变体对于所有的激动剂与拮抗剂均丧失了反应活性;c/d/gMC5R-F254A和 pMC5R-F339A 的反应活性明显降低;c/d/gMC5R-H257A 和 pMC5R-H342A 对于 α-MSH和NDP-α-MSH表现出了反应活性下降或丧失;MC3R和MC4R的拮抗剂SHU9119在c/d/g/sMC5R表现出激动剂的作用,c/d/gMC5R-H257A对SHU9119的信号窗显著增大;pMC5R-H342A对SHU9119表现为信号窗的减小和EC50升高。其中,我们仅检测到了突变体c/d/gMC5R-F254A和pMC5R-F339A,对于拮抗剂AgRP的刺激有响应。3.将四种动物的MC5R和突变体真核表达载体分别转染至HEK293T中,提取总蛋白,利用Western Blot检测胞内ERK1/2的基础磷酸化水平和配体刺激后的磷酸化水平。结果显示,c/gMC5R-F254A/H257A 的 pERK1/2 基础水平下降,pMC5R-F339A/H342A 的pERK1/2基础水平显著性升高,dMC5R的3个突变体无显著性变化。在激动剂NDP-α-MSH 作用下,cMC5R-F254A 的 pERK1/2 水平升高,pMC5R-F254A 的 pERK1/2 水平下降,其余受体和突变体的pERK1/2水平均无明显变化;在拮抗剂AgRP作用下,c/d/gMC5R-H257A 和 pMC5R 的 pERK1/2 均没有显著性变化,cMC5R-F254A 和 dMC5R-F254A 表现为pERK1/2水平升高,其余受体和突变体均表现为pERK1/2水平的降低。
【图文】：

将上一步中的ＰＣＲ产物，用ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓ？ＩＩ邋Ｏｎｅ邋Ｓｔｅｐ邋Ｃｌｏｎｉｎｇ邋Ｋｉｔ与真核表达载体逡逑ｐｃＤＮＡ３．丨（＋）经同源重组方法连接，转化至ＤＨ５ａ感受态细胞后，挑取单菌落送往测序，得逡逑到的结果如图２．２所示。鸡、鸭、鹅ＭＣ５Ｒ的测序结果显示序列各与ＧｅｎｅＢａｎｋ中的一个逡逑预测序列完全一致；猪ＭＣ５Ｒ的测序结果比ＧｅｎｅＢａｎｋ的预测序列（１２３３ｂｐ）从５’端开始逡逑多了邋１０８ｂｐ￣１６４ｂｐ与２８８ｂｐ？３７１ｂｐ的片段，其余ＤＮＡ序列完全匹配。逡逑Ａ逡逑ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＧＣＡＡＣＴＧＴＡＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＣＩＡＡＡＣＣＴＧＡＧＴＧＣＣＴＴＴＧＧＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＡＣＴ逡逑ＧＴＧＣＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＣＡＴＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＡＡＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＴ逡逑ＧＴＡ－＼ＧＣＣＴＣＣＴＴＧＡＡ－Ａ．ＡＴＡｒＣＴＴＡＧＴＧＡＴＡＴＧＴＧＣＡＡＴＡＧｒＴＡＡＧＡＡＣＡＡＧＡＡＣＴＴＡＣＡＴＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＡＴＴｒｒｒＴＴＧＴ逡逑ＴＴＧＣＡＧｍＡＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＴＡＧＣＧＴＧＴＣＴＡＡＴＧＣＴＴＧＧＧＡＧＡＣＣＡＴＡＡＣＡＡＴＡＴＡＣＴＴＡＡＴＡＡＡＣＡＡＴ逡逑ＡＧＧＣＡＣＡｒＡＡＴＴＡｒＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＴＴＣＧＴＣＣＧＴＣＡＴＡＴＡＧＡＣＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＡｒＴＣＡＣＴＧＡＴＣＴＧＣＡＴＡｒＣＴＧＴＧＧＴＧＧＣ逡逑ＴＴＣＣＡＴＧＴＧＣＡＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＡＡＴＡＧＣＡＧＴＡＧＡＣＡＧＡＴＡＴＡＴＣＡＣ

ｉ逦ｌ逡逑ｉ逦ｓ逡逑图２．３邋ＭＣ５Ｒ核苷酸序列系统进化树逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．３邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋ＭＣ５Ｒ邋ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ逡逑３．３重组质粒的电泳鉴定结果逡逑将提取的测序正确的ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｃ／ｄ／ｇ／ｐＭＣ５Ｒ，用超微量分光光度计测定核酸浓度逡逑后，稀释成相同浓度，用１％琼脂糖凝胶电泳鉴定，，结果如图２．４所示，３０＾０ｂｐ？５０００ｂｐ之逡逑间的条带为超螺旋质粒，５０００ｂｐ以上为线性质粒，ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｃ／ｄ／ｇ／ｐＭｄ５Ｒ重组质粒与逡逑ｐｃＤＮＡ３．１（＋）空载体与预期大小一致，且样品ＤＮＡ浓度接近。逡逑Ｍ邋１逦２逦３逦４逦５逡逑＿围！ｒ＿逡逑：：１”邋感逡逑图２．４重组ＭＣ５Ｒ质粒的电泳鉴定逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．４邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＭＣ５Ｒ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐｌａｓｍｉｄ逡逑Ｍ，邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ，邋１，邋ｐｃＤＮＡ３．１邋（－＾ｙｃＭＣ５Ｒ，邋２，邋ｐｃＤＮＡ３．１邋（＾ｙｄＭＣ５Ｒ，逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S828;S834;S835;S831

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本文编号：2702003