精源性miR-183靶向Ezrin调控牛早期胚胎微绒毛结构与发育质量的研究

发布时间：2020-06-07 17:46

【摘要】：成熟的精子中包含编码RNA和非编码RNA,精子在受精时将这些RNA携带进入卵母细胞。越来越多的证据显示精子miRNAs作为具有调控功能的内源性小分子非编码RNA,可以与卵母细胞内靶基因的3’非翻译区进行特异性碱基互补配对结合,降解或者抑制靶基因翻译。从而对受精后胚胎表观重编程、表观遗传、胚胎发育以及后代表型等产生重要影响。本课题组的前期研究发现miRNA-183在牛精子中特异性高表达,对早期胚胎的发育起着重要的作用,并且通过生物信息学分析和双荧光素实验确定了Ezrin是其在早期胚胎中发挥功能的靶基因。在此基础上,本研究主要开展以下三个方面的工作,(1)确定miRNA-183与靶基因Ezrin在早期胚胎中的调控关系;(2)通过敲降和过表达实验,明确miRNA-183对早期胚胎具体表型的影响;(3)初步探讨miRNA-183对早期胚胎发育的调控机制。主要研究成果如下:1.通过显微注射的方法,向孤雌胚胎注射miRNA-183 mimic和miRNA-183 mimic NC。同时对孤雌胚胎显微注射EZR siRNA和EZR siRNA NC作为对照,从RNA和蛋白水平验证miRNA-183与其靶基因Ezrin的靶向调控关系。发现注射EZR siRNA的效果与注射miRNA-183 mimic的效果相似,都可以有效使Ezrin蛋白表达荧光强度显著降低。同时通过qPCR和Western blot实验证明miRNA-183可同时在mRNA和蛋白水平调控Ezrin表达量。2.功能获得实验表明miRNA-183显著提高了牛体细胞核移植胚胎的卵裂率(76.63%vs 64.32%,P0.05)、囊胚率(43.75%vs 28.26%,P0.05),降低了第7 d囊胚凋亡率(5.21%vs 12.64%,P0.05),提高第7 d囊胚内细胞团滋养层比例(32.65%vs25.58%,P0.05)。3.扫描电镜观察发现SCNT胚胎表面微绒毛密度显著高于IVF胚胎,向核移植胚胎显微注射miRNA-183 mimic胚胎表面微绒毛密度显著降低。注射EZR-siRNA也有相同的效果,结果表明miRNA-183可能通过靶基因Ezrin调控早期胚胎微绒毛形成,从而最终影响胚胎的发育潜能。4.通过生物信息学预测筛选与微绒毛功能作用相关并与Ezrin存在互作的蛋白,利用Co-IP结合质谱筛选出相关蛋白,利用免疫荧光共定位的方法验证Ezrin与这些互作蛋白在牛早期胚胎中的互作关系。为后续进一步探讨miRNA-183通过其靶基因Ezrin调控胚胎早期微绒毛形成的机理研究奠定基础。综上所述,在前期研究的基础上,本研究进一步明确了miRNA-183与其靶基因Ezrin的调控关系,研究了其对牛SCNT胚胎发育和微绒毛形成的影响,并筛选了与Ezrin互作的蛋白,为后续进一步研究miRNA-183通过其靶基因Ezrin调控牛早期胚胎发育的机理奠定基础。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S823

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本文编号：2701775