酿酒酵母β-葡聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞和外植体内β-防御素-1表达影响的研究

发布时间：2020-06-08 21:38

【摘要】：绵羊瘤胃作为反刍动物的第一个胃,经常会受到各种病原微生物的挑战。绵羊瘤胃黏膜上皮在先天性免疫中发挥重要作用,并可以分泌一系列先天免疫分子来防止微生物的侵袭。防御素是一种由黏膜上皮产生并具有广谱抗微生物活性的阳离子肽,被认为是抗生素的潜在替代品。本课题组先前的研究表明酿酒酵母全细胞壁能够上调绵羊瘤胃上皮细胞(Ovine ruminal epithelial cells,ORECs)内 β-防御素-1(Sheepβ-defensin-1,SBD-1)的表达,为了进一步确定酿酒酵母细胞壁诱导SBD-1表达的有效成分,本研究选用来源于酿酒酵母细胞壁的β-葡聚糖刺激ORECs以观察其对SBD-1表达的影响,并进一步研究此诱导过程可能涉及的信号通路。外植体培养具有在受控环境中保留与体内相似的组织学特征等特点,因此外植体培养相对于细胞而言更接近于体内环境。本研究探索了绵羊瘤胃外植体(Ovine ruminal explants,OREs)培养的可行性和最佳条件,并在此基础上研究β-葡聚糖对OREs内抗菌肽SBD-1、促炎细胞因子IL-6和抗炎细胞因子IL-10表达的影响。具体研究内容及结果如下:(1)用不同浓度(0、5、10、20、50和100 μg/mL)的β-葡聚糖刺激ORECs 8 h后,利用qPCR和ELISA方法检测SBD-1的表达变化,从而筛选出诱导SBD-1表达最佳的β-葡聚糖浓度,而后用此浓度刺激ORECs不同时间(0、2、4、8、12和24 h),同样采用qPCR和ELISA方法筛选出诱导SBD-1表达的最佳时间。结果显示:10μg/mL的β-葡聚糖分别刺激ORECs 2和4 h时SBD-1 mRNA和蛋白表达最大。(2)采用Western blot、RT-PCR、免疫组化、免疫荧光、qPCR和ELISA方法检测β-葡聚糖诱导SBD-1表达上调的信号通路。结果表明树突状细胞相关C型凝集素 1(Dendritic-cell-associated C-type lectin 1,Dectin-1)和脾脏酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase,Syk)在绵羊瘤胃黏膜组织及ORECs内表达,并且用siRNAs干扰或抑制剂抑制Dectin-1、Syk、TLR-2和MyD88表达后减弱了β-葡聚糖诱导的SBD-1表达。用β-葡聚糖处理ORECs导致p38、JNK、ERK1/2和NF-κB表达显著增加,而用抑制剂抑制MAPK和NF-κB途径显著降低了 β-葡聚糖诱导SBD-1的表达,且NF-κB抑制剂效果最明显。(3)培养OREs,并采用H.E染色、qPCR和免疫组化等方法检测OREs的组织结构完整性及细胞活性。H.E染色结果显示:不添加血清的培养基内OREs组织结构更完整。qPCR和免疫组化结果显示:培养24 h以内的OREs E-cadherin的表达与未培养的组织差异不显著,且存在CK-18和Ki-67的阳性信号。(4)将OREs与不同浓度(0、10、50、100、200和400 μg/mL)的β-葡聚糖共培养8 h后,采用qPCR和ELISA方法检测SBD-1、IL-6和IL-10的表达变化,从而筛选出诱导SBD-1、IL-6和IL-10表达最佳的β-葡聚糖浓度,而后用此浓度刺激ORECs不同时间(0、2、4、8、12和24 h)后,同样采用qPCR和ELISA方法筛选出诱导SBD-1、IL-6和IL-10表达的最佳时间。结果显示:50 μg/mL的β-葡聚糖分别刺激OREs 2、8 和 12 h 时 SBD-1、IL-6 和 IL-10 的 mRNA 表达最高,100 pg/mL 的 β-葡聚糖刺激OREs 8 h时SBD-1蛋白表达达到峰值,而分别用50和200 μg/mL刺激OREs 12 h时IL-6和IL-10蛋白表达达到最大。本研究结果表明β-葡聚糖能够提高ORECs内SBD-1的表达,且该过程由Dectin-1-Syk/TLR-2-MyD88-MAPK/NF-κB信号通路共同介导产生,但可能主要通过Dectin-1-Syk/TLR-2-MyD88-NF-κB信号通路。此外,本研究还确定了 OREs体外培养的可行性和最佳条件,并证明β-葡聚糖可以激活OREs中SBD-1、IL-6和IL-10的分泌。
【图文】：

脊椎动物,嗜中性粒细胞,半胱氨酸,上皮细胞

ｗ。根据细胞位置、表达谱、半胱氨酸间隔和二硫化物（Ｓ－Ｓ）键连接性，脊椎动物逡逑防御素可以进一步细分为ａ－防御素、Ｐ－防御素和０－防御素（图１－丨）。逡逑ｐ逦ａａｉｋｒｋ逦ａ，ｉｉ＾ｄｂｉ４逦ｔ逡逑人逦＾３７逦２逦３逡逑鼠逦？４９逦以逦＾逦－逡逑恒河猴逦ｙ逦６逦６逦ｊ逡逑图１－１防御素的分类［１°］逡逑Ｆｉｇ．邋ｌ－ｌ邋Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ逡逑１．３逦（３邋＿防御素逡逑Ｐ－防御素是最大的脊椎动物防御素家族，最初是从牛的上皮细胞和嗜中性粒细胞逡逑中分离出来的ｍ］，随后Ｐ－防御素被发现几乎存在于所有脊椎动物中ｎ２］。Ｐ－防御素产生逡逑并储存于上皮细胞、嗜中性粒细胞和吞噻细胞中。在病原体感染期间，储存在颗粒体逡逑中的Ｐ－防御素会释放到吞噬体或细胞外系统中，，构成体内第一道防线，从而防御病原逡逑体入侵。逡逑１．３．邋１邋Ｐ－防御素的结构与分布逡逑Ｐ－防御素的基因由两个外显子组成，并聚集在４或５个基因组区域ｎ３］，其成熟肽逡逑一般含有３８？４２个氨基酸，其中６个保守的半胱氨酸组成３对二硫键分别为逡逑Ｃｙｓｌ－Ｃｙｓ５、Ｃｙｓ２－Ｃｙｓ４、Ｃｙｓ３－Ｃｙｓ６

防御反应,益生菌,肠上皮,黏蛋白

先天和适应性防御反应（如分泌黏蛋白、防御素、三叶因子、免疫球蛋白Ａ逡逑（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ邋Ａ，邋ＩｇＡ）、Ｔｏｌｌ邋样受体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＴＬＲｓ）、细胞因子、逡逑肠相关淋巴组织和信号通路等）［４４＿？（图１－２）。逡逑
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.2

【参考文献】