肺炎链球菌感染小鼠中性粒细胞诱导IL-1β成熟与分泌的机制

发布时间：2020-06-08 19:54

【摘要】：肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)是一种主要定植于人体上呼吸道鼻咽部黏膜的革兰氏阳性胞外菌,主要感染免疫力低下的老人及五岁以下的儿童,可引起人的脑膜炎、中耳炎、败血症等疾病,同时也是社区获得性肺炎的主要病原。肺炎链球菌溶血素(Pneumolysin,PLY)作为该菌的主要毒力因子,在肺炎链球菌感染宿主、诱导宿主免疫应答中扮演着重要角色。肺炎链球菌感染可诱导宿主免疫细胞分泌IL-1家族、TNFα等细胞因子,这些细胞因子进一步诱导机体免疫应答,对宿主抗肺炎链球菌感染具有重要的保护性作用。促炎因子IL-1β在宿主抗肺炎链球菌感染中的作用尤为重要。本课题组前期已经研究报道了肺炎链球菌感染小鼠巨噬细胞诱导IL-1β成熟及分泌的详细机制:肺炎链球菌感染巨噬细胞过程中,少量肺炎链球菌被巨噬细胞吞噬,后由于其毒力因子PLY的穿孔作用使吞噬体裂解,其中的内容物被释放至胞浆激活AIM2及NLRP3炎症小体,通过活化caspase-1切割IL-1β前体并使之分泌。作为固有免疫系统中的重要一员,中性粒细胞可通过发挥吞噬作用,释放一系列趋化因子、细胞因子,在宿主抗肺炎链球菌感染时发挥重要作用。同时中性粒细胞也是机体产生IL-1β的重要来源,且IL-1β与中性粒细胞在抗肺炎链球菌感染中的作用已经明了,但肺炎链球菌是如何诱导中性粒细胞产生IL-1β仍不清楚,有待进一步研究。对此,本研究使用肺炎链球菌感染小鼠腹腔中性粒细胞,研究肺炎链球菌感染中性粒细胞诱导IL-1β加工分泌的机制。1.肺炎链球菌溶血素(PLY)在IL-1β成熟与分泌中的作用研究使用肺炎链球菌野生型菌株D39和ply基因缺失株△pl分别感染小鼠腹腔中性粒细胞,ELISA检测培养上清中的IL-1β、IL-1α、IL-6及TNFα分泌水平;使用Western blot方法检测培养上清及细胞裂解物中IL-1β前体及成熟片段的蛋白表达水平。最后,为进一步鉴定PLY在诱导中性粒细胞IL-1β分泌中的作用,使用重组蛋白rPLY感染小鼠腹腔中性粒细胞,采用ELISA方法检测培养上清中IL-1β的分泌水平。以上试验结果显示:肺炎链球菌菌株D39和△ply感染小鼠腹腔中性粒细胞后,均可引起细胞因子IL-1α、IL-6及TNFα分泌,且两种菌株诱导的分泌水平无显著差异,而△ply引起的IL-1β分泌量显著低于D39;在D39和△ply感染中性粒细胞后,细胞裂解物中均可检测到IL-1β前体片段,而IL-1β成熟片段仅在培养上清中检测到;此外,使用rPLY感染中性粒细胞后,发现rPLY诱导的IL-1β分泌量呈剂量依赖型。综合上述试验结果揭示:在肺炎链球菌感染小鼠中性粒细胞时,可诱导中性粒细胞分泌IL-1β、IL-1α、IL-6及TNFα等一系列细胞因子,且PLY参与了 IL-1β的成熟与分泌过程,并起到了关键性作用。2.NLRP3炎症小体在肺炎链球菌感染小鼠中性粒细胞诱导IL-1β成熟与分泌中的作用研究为鉴定中性粒细胞吞噬作用对IL-1β分泌的影响,在肺炎链球菌野生型菌株D39感染中性粒细胞前使用细胞松弛素B(Cytochalasin B,Cyto.B)处理小鼠腹腔中性粒细胞,而后通过ELISA检测培养上清中IL-1β的分泌水平,结果显示在使用Cyto.B处理后,IL-1β分泌显著降低,揭示中性粒细胞对该病原菌的吞噬作用参与肺炎链球菌感染中性粒细胞时IL-1β的分泌。为确定NLRP3炎症小体是否参与肺炎链球菌感染中性粒细胞时IL-1β成熟与分泌过程,使用肺炎链球菌野生型菌株D39 分别感染 C57BL/6WT 及 Caspase-1-/-、ASC-/-、NLRP3-/-、NLRC4-/-及 AIM2-/-炎症小体组分敲除小鼠的腹腔中粒细胞,使用ELISA方法对培养上清中IL-1β的分泌水平进行检测,Western blot检测培养上清中的IL-1β成熟形式及caspase-1活化形式,同时测定细胞裂解物中的IL-1β前体、caspase-1前体及NLRP3、ASC分子的蛋白表达水平,结果表明相较于WT小鼠中性粒细胞,Caspase-1-/-、ASC-/-、NLRP3-/-小鼠的中性粒细胞在肺炎链球菌D39感染后几乎不分泌IL-1β,也检测不到IL-1β、caspase-1成熟形式,而NLRC4-/-及AIM2-/-小鼠中性粒细胞中IL-1β分泌量与WT小鼠中性粒细胞的无明显差异。为研究钾离子外流对肺炎链球菌感染中性粒细胞时IL-1β分泌的影响,在肺炎链球菌野生型菌株D39感染小鼠中性粒细胞的同时于感染体系中加入高浓度的钾离子以阻断胞内钾离子外流,ELISA检测培养上清中IL-1β的分泌水平,Western blot检测培养上清中caspase-1活化形式,结果显示在加入高浓度的钾离子后,IL-1β分泌量显著降低,也未检测到caspase-1活化片段。此外,为研究炎症小体上游的JNK及Syk信号通路在肺炎链球菌感染中性粒细胞时诱导IL-1β成熟与分泌中的作用,在肺炎链球菌野生型菌株D39感染前分别使用JNK、Syk抑制剂SP600125、R406处理中性粒细胞,而后ELISA检测上清中IL-1β分泌水平,试验结果显示:在使用JNK抑制剂预处理后IL-1β分泌量显著降低;而后Western blot检测D39感染后JNK分子的磷酸化水平,结果发现在D39感染后各时间点JNK出现磷酸化,同时使用SP600125处理后个时间点JNK磷酸化水平均出现明显降低。Western blot检测使用两种抑制剂分别处理后培养上清中IL-1β、caspase-1成熟形式及使用DSS交联后细胞中ASC蛋白的寡聚化水平,结果显示在使用SP600125处理后未检测到IL-1β蛋白成熟形式、caspase-1活化片段且ASC寡聚化水平亦显著降低。以上结果表明:在肺炎链球菌感染中性粒细胞时,NLRP3炎症小体通过活化caspase-1而参与IL-1β的成熟与分泌;钾离子外流可通过影响caspase-1活化而影响IL-1β分泌;另外,炎症小体上游的JNK通路在肺炎链球菌感染后可发生磷酸化并通过调节ASC分子的寡聚化水平进而影响caspase-1活化及IL-1β的成熟与分泌;此外,中性粒细胞吞噬作用在IL-1β分泌中扮演了重要角色。3.丝氨酸蛋白酶类对肺炎链球菌感染中性粒细胞时诱导IL-1β成熟与分泌影响的研究为探究中粒细胞中的丝氨酸蛋白酶在肺炎链球菌感染中性粒细胞诱导IL-1β成熟与分泌中的作用,在肺炎链球菌野生型菌株D39感染前使用丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、中性粒细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂ONO-5046、泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理中性粒细胞,而后ELISA检测培养上清中IL-1β分泌水平,Western blot检测IL-1β成熟片段、caspase-1活化形式及使用DSS交联后的ASC蛋白的寡聚化水平,结果显示在使用PMSF及ONO-5046处理后,IL-1β分泌水平显著降低,IL-1β成熟片段减少、caspase-1活化水平及ASC寡聚化水平均显著降低。表明在肺炎链球菌感染中性粒细胞时,丝氨酸蛋白酶可通过调节ASC寡聚化水平进而影响caspase-1的活化及IL-1β的分泌水平。综上所述,本研究使用肺炎链球菌感染小鼠中性粒细胞,证明了肺炎链球菌感染中性粒细胞过程中,PLY在诱导IL-1β成熟与分泌中发挥重要作用。肺炎链球菌被中性粒细胞吞噬,通过活化NLRP3炎症小体激活caspase-1引起IL-1β分泌,且NLRP3炎症小体上游的钾离子外流及JNK信号通路参与调节这一过程;此外,中性粒细胞丝氨酸蛋白酶也可通过调节ASC分子寡聚化影响caspase-1活化进而参与IL-1β成熟与分泌。
【图文】：

中性粒细胞,诱导细胞

图３－１邋ＳＰ以不同条件感染中性粒细胞后诱导细胞因子分泌逡逑２１逡逑

肺炎链球菌感染,中性粒细胞,诱导细胞

１２ｈ后ＥＬＩＳＡ检测培养上猜中细胞囡子ＩＬ－ｉｐ、ＴＮＦａ、ＩＬ－ｌａ、ＩＬ－６的分泌情逡逑况。结果表明」和Ｄ３９菌株能够诱导中性粒细胞分泌这些细胞因子，，且其中逡逑Ｄ３９所引起得ＩＬ－ｉｐ分泌水平显著高于伞（ｖ感染后的分泌量（图３－２邋Ａ）；而两种逡逑菌株所引起的ＴＮＦａ、ＩＬ－ｌａ、ＩＬ－６分泌水乎均无显著差异（＊邋ｐ邋＜邋０．０５）（图３－２逡逑Ｂ，Ｃ，Ｄ）．逡逑Ａ，逦Ｂ．逦Ｃ．逦Ｄ．逡逑１５００－１逦１５００－１逦４００００邋－逡逑ＩＩ：邋｜邋Ｉ－Ｊ邋１１邋！逦１１邋１逦１１逡逑Ｉ邋＾逦１１邋ｉ邋，0邋１１邋Ｉ邋２３０００邋１邋１逡逑0ｌｕＸ邋0ＬＵ邋：ｌｕＸ逡逑ＵＩ邋Ｄ３９邋Ｊｐｌｙ逦ＪＪＪ邋Ｄ３？邋Ｊｐｔｙ逦ＬＩ邋Ｄ３９邋Ａｐｌｙ逦ＬＩ邋Ｄ３９邋Ａｐｌｙ逡逑图３－２肺炎链球菌感染中性粒细胞诱导细胞因子的分泌水平逡逑Ｆｉｇ．邋３－２邋Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ邋ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ邋ｉｎ邋ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ逡逑注：相较于」／办组，＊ｐ＜０．０５逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ｓｙｍｂｏｌｓ邋ｉｎｄｉｃａｔｅ邋ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｖｅｒｓｕｓ邋Ａｐｌｙ邋ｇｒｏｕｐ，邋＊邋ｐ邋＜邋０．０５逡逑３．３．３邋ＰＬＹ参与中性粒细胞ＩＬ－１｜３的成熟与分泌逡逑用肺炎链球菌野生型菌株Ｄ３９和；基因敲除株却分别感染小鼠腹腔中性粒逡逑细胞，１２邋ｈＭ邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测培养上清、细胞裂解物中ＩＬ－ｉｐ、Ｐｒｏ－ＩＬ－ｉｐ的蛋白逡逑表达水平
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61

【参考文献】