猪胸膜肺炎放线杆菌重组串联表位抗原的设计表达及免疫保护作用

发布时间：2020-06-08 23:46

【摘要】：猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种接触性呼吸道传染病,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。该病常与其它疾病混合感染或继发感染,使病情更加复杂,免疫预防成为了防控该病的重要途径。但是,APP分为16个血清型,且主要的血清型之间缺乏交叉免疫保护,导致疫苗研究进展缓慢。APP疫苗研究主要集中在亚单位结构上,但其结构复杂,分子较大,暴露在分子表面的有效抗原表位较少。有关APP表位疫苗的研究鲜有报道,表位疫苗免疫后细胞因子变化的相关研究更是少见。因此,设计APP表位疫苗并研究其免疫对攻毒后细胞因子的影响,对于更好地预防该病具有重要意义。课题组前期研究发现APP的三聚体自转运粘附素(TAA)的头部(ADH)是其关键功能区,在细菌的粘附、侵袭、生物被膜的形成和逃避宿主免疫应答方面有重要作用,而且ADH对APP的感染具有免疫保护作用。另外,课题组发现痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes,PA)与APP有较强的交叉免疫保护,其共同抗原表位Ba1、Bb5、C1可以有效地预防APP感染。此外,深入研究发现APP的外毒素ApxⅣ上的表位PH1、高亲和力细胞周质锌转运蛋白上的表位PH2与PA的单链DNA结合蛋白具有较高的同源性,且对APP感染具有较好的免疫保护效果。为研究表位抗原的免疫效果和细胞因子对免疫效果的影响,本试验利用DNAstar软件和Bepipred 1.0共同预测ADH的有效抗原表位,并将其与Ba1、Bb5、C1、PH1和PH2通过柔性linker串联起来,并比较获得最佳组合序列。基因合成后构建原核表达载体p ET28a-RTA,经大肠杆菌BL21原核表达后通过镍柱亲和层析法纯化出目的蛋白RTA。在0、14、28 d时将其与铝胶盐水佐剂混匀后背部皮下免疫ICR小鼠,同时设置APP5b活菌、APP1灭活菌、APP5b灭活菌和PBS组作为对照,并在0、14、28、35 d分别进行尾静脉采血以检测血清抗体效价。在35 d进行APP1和APP5b攻毒前24 h和0 h分别给两组RTA蛋白免疫组进行腹腔注射IL-2、滴鼻GM-CSF处理。攻毒感染后观察临床症状和小鼠体重丢失情况,3天后处死小鼠,检测肺指数、肺匀浆中T淋巴细胞数、存活率以及BALF和血清中细胞因子的变化情况,以评价RTA蛋白的免疫保护效果和对细胞因子的影响及IL-2、GM-CSF的预处理对RTA蛋白保护效果的影响。结果显示,RTA蛋白大小为20.6 k Da,其最佳表达条件是37℃诱导表达6-8 h。Western blot结果显示RTA蛋白与抗APP5b高免血清具有良好的结合活性。将RTA蛋白免疫后,ICR小鼠产生了103数量级的抗体效价,且产生的抗体能与APP1和APP5b特异性结合。攻毒感染后RTA蛋白有效地减轻了临床症状和体重丢失,IL-2和GM-CSF预处理后肺指数略高于RTA免疫组,IL-2的预处理使肺匀浆中的T细胞数减少,GM-CSF则不影响T细胞的数目。RTA蛋白免疫使小鼠对APP1感染产生了40%的保护率。这些结果表明RTA蛋白对APP感染有一定的免疫保护作用,IL-2和GM-CSF预处理降低了RTA蛋白的保护作用。此外,RTA免疫组细胞因子IL-17、IL-1β、Fas-Ligand、IL-21、G-CSF、CCL4水平降低,表明RTA免疫有效地降低了炎症反应的发生。与RTA组相比,IL-2和GM-CSF预处理上调了TNF-α、IL-1β、IL-21、G-CSF、GM-CSF、CCL4等炎性因子,加重了炎症反应,从而降低了RTA蛋白的免疫保护效果。本研究设计了表位抗原RTA,并通过临床症状、体重丢失、存活率和细胞因子变化等指标综合评价了RTA蛋白的免疫保护效果,为APP新型表位疫苗的设计提供了理论基础,对于预防APP的感染具有重要意义。
【图文】：

序列,基序,粘附,区域位

图 1.1 ADH 粘附基序分布Fig 1.1 The distribution of adhesion gene sequence of ADH利用 DNAstar 对 124-612 aa 处粘附序列进行表位预测，，根据 Chou-Fasman法和Garnier-Robson法预测ADH的二级结构，可见共同α螺旋区域位于333-334、449-453 aa 处，共同 β 折叠区域位于 144-162、176-184、189-192、218-221、255-257、280-287、344-346、357-360、372-374、385-389、402-405、410-421、440-443、469-471、510-512、525-529、535-540、550-554、564-569、574-583、597-599、608-612 aa 处，无规则卷曲位于 125-128、223-225、236-238、258-265、275-279、306-308、323-325、421-423、431-439、522-523、569-573、586-588、600-603 aa处（图 1.2）。

序列,粘附,基序,区域位

图 1.1 ADH 粘附基序分布Fig 1.1 The distribution of adhesion gene sequence of ADH利用 DNAstar 对 124-612 aa 处粘附序列进行表位预测，根据 Chou-Fasman法和Garnier-Robson法预测ADH的二级结构，可见共同α螺旋区域位于333-334、449-453 aa 处，共同 β 折叠区域位于 144-162、176-184、189-192、218-221、255-257、280-287、344-346、357-360、372-374、385-389、402-405、410-421、440-443、469-471、510-512、525-529、535-540、550-554、564-569、574-583、597-599、608-612 aa 处，无规则卷曲位于 125-128、223-225、236-238、258-265、275-279、306-308、323-325、421-423、431-439、522-523、569-573、586-588、600-603 aa处（图 1.2）。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4

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