抗弓形虫天然产物筛选与甘草查尔酮A抗虫研究

发布时间：2020-06-09 06:12

【摘要】：弓形虫是专性胞内寄生原虫,临床可以感染人及温血动物,并造成严重的公共健康问题。尽管弓形虫病对人和动物具有较大的威胁,并且已经造成严重的经济损失,但临床上的治疗手段仍然是有限的,并且存在不能根治和副作用较大的问题。天然化合物作为巨大的化合物库,是抗弓形虫药物新药研发的重要资源。本试验选取了一系列具有抗癌和抗寄生虫活性的中药的主要活性单体进行体外抗弓形虫活性筛选,并在体内和体外对筛选出的天然产物的药效进行系统性的评价,初步探索其抗弓形虫机理,为临床治疗与抗弓形虫药物的开发提供理论依据。首先采用MTT法,测定不同浓度下黄芩苷、汉黄芩苷、甘草苷、甘草查尔酮A、氢溴酸槟榔碱、川楝素、对叶百部碱、鸦胆子素D、绿原酸、L-扁桃酸和D-扁桃酸对HFF细胞的细胞毒性,找出对HFF细胞生存的最小抑制浓度(生存率95%)。并在最小抑制浓度下,进行体外抗弓形虫活性筛选,通过Giemsa染色观察抗虫效果。细胞毒性试验结果显示:11种天然产物对HFF细胞生存最小抑制浓度分别为:黄芩苷200μg/mL,汉黄芩苷80μg/m L,甘草苷70μg/m L,甘草查尔酮A 10μg/m L,氢溴酸槟榔碱20μg/m L,川楝素5μg/m L,对叶百部碱40μg/m L,鸦胆子素D 1μg/m L,绿原酸400μg/m L,L-扁桃酸80μg/m L,D-扁桃酸80μg/m L。经初步抗虫活性筛选试验显示:11种天然产物中,甘草查尔酮A具有明显的抗弓形虫增殖的作用。为了确定甘草查尔酮A在培养基中的保留时间,采用高效液相色谱法对培养基中甘草查尔酮A浓度进行测定,并绘制药时曲线。结果表明,甘草查尔酮A在0.01-2.0μg/m L的浓度范围内,线性关系良好,且此方法的专属性好,回收率较高,精密度较好。测定甘草查尔酮A在培养基中的浓度随着时间逐渐下降,且在48 h时三个浓度(1.2μg/m L、1.0μg/m L、0.5μg/m L)的甘草查尔酮A均检测不到。为考察甘草查尔酮A对弓形虫速殖子入侵HFF细胞的影响。培养基中加入甘草查尔酮A后加入弓形虫速殖子孵育2 h,弃去药物培养基继续培养24 h,用Giemsa染色观察甘草查尔酮A对弓形虫入侵宿主细胞的影响,试验结果显示甘草查尔酮的浓度高于1μg/m L时,可以完全抑制虫体的入侵,并呈剂量依赖。为确定甘草查尔酮A的抗虫体增殖效果和准确测定对虫体增殖的IC_(50),首先,建立了用荧光定量PCR评价虫体荷载量的方法,并采用此方法对不同浓度的甘草查尔酮A作用下的虫体荷载量进行测定,计算甘草查尔酮A对弓形虫的IC_(50)。同时,用Giemsa染色法观察不同浓度的甘草查尔酮A对弓形虫增殖的影响。结果显示,建立的评价虫体荷载量的荧光定量PCR的方法精密度和回收率的RSD值均小于5。Giemsa染色表明:随着甘草查尔酮A的浓度的升高,处理孔内的包囊数,速殖子数,和纳虫囊泡内的平均虫体数均降低呈剂量依赖。用荧光定量PCR测定在各个甘草查尔酮A浓度下的虫体荷载量,结果与Giemsa染色结果一致,并且通过计算得出,甘草查尔酮A对弓形虫速殖子的半数抑制浓度IC_(50)值为0.848μg/mL。为探究甘草查尔酮A抑制虫体增殖的机制,采用扫描电镜和透射电镜观察甘草查尔酮A对弓形虫的超微结构的影响,随后采用尼罗红染色,用激光共聚焦显微镜观察脂质富集,并用流式细胞仪对荧光强度进行测定。扫描电镜显示:不同浓度处理后弓形虫速殖子变小变圆,表面出现凹陷,并且浓度越大越明显。透射电镜结果显示:同一浓度处理下,速殖子内部出现脂体,并且随着时间的延长脂体逐渐增多,各个细胞器的膜结构消失,最终虫体死亡。尼罗红染色证明了这一现象,可以观察到中性脂类在虫体内蓄积的情况,并随着时间的延长积累加剧。表明甘草查尔酮A是通过干扰脂代谢而引起虫体死亡。在体内,首先确定口服和腹腔注射的最大安全给药剂量和给药次数。建立体内弓形虫急性感染模型,采用口服和腹腔注射两种方式对不同浓度甘草查尔酮A的体内抗虫效果进行评价。口服甘草查尔酮A最大剂量达到1000 mg/kg没有出现不良反应,在腹腔注射时剂量达到为386 mg/kg.bw时,小鼠出现死亡。24 h内腹腔注射3次,给药在达到1000mg/m L时未发现死亡现象。在小鼠急性感染模型治疗实验中,低剂量腹腔注射组存活率为80%,中剂量腹腔注射组存活率为90%,高剂量腹腔注射组的存活率为100%,口服各剂量组没有改变死亡的结局,但平均存活时间均有延长,但各剂量组之间没有显著差异。安全性实验结果显示,在此给药方式下各组小鼠均无死亡,采取各器官,切片做HE染色均无发现异常。终上所述:甘草查尔酮A可以抑制弓形虫速殖子的入侵和复制,提高感染小鼠的生存率,超微结构观察显示,甘草查尔酮A的抗虫机制与脂代谢相关。本试验结果表明甘草查尔酮A是潜在的抗弓形虫化合物,有望开发成为抗弓形虫药物。
【图文】：

形态图,弓形虫,形态,速殖子

进行分裂生殖。速殖子（Tachyzoite）宽 2-4μm，长 4-8μm，是弓形虫快速繁殖阶段的生命形态（如图1-1 F 所示）。该时期虫体一端尖锐，，一端钝圆，中央膨大呈新月形或弓形。速殖子可以主动入侵进入所有的有核细胞，在胞质内形成纳虫囊泡（ParasitophorousVacuole,PV）。速殖子的增值，将会使被感染的宿主细胞胀破，释放出的速殖子经血液流动散播至全身，并感染多种组织，包括中枢神经系统、眼、骨骼肌、心肌和胎盘等。溢出的虫体侵入邻近细胞，引起强烈的炎症反应和组织损伤，因此弓形虫病的大部分临床症状也都由此而来。当速殖子处于抗弓形虫药物或宿主的免疫反应的状态下时，会形成包囊（Cyst or Tissue Cyst）并转化为缓殖子。

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图 1-2 弓形虫的生命周期和弓形虫病的临床表现（Montoya, 2004）Fig. 1-2 Life cycle of T gondii and clinical manifestations of toxoplasmosis孕妇在怀孕期间初次感染弓形虫后，寄生虫通过胎盘进入胎儿循环引起胎儿先天感染。先天性弓形虫病的患病率在万分之一到万分之十之间[58,59]。孕妇在怀孕前已经感染对胎儿
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S853.7

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