核仁素在兔出血症病毒感染与复制中的作用

发布时间：2020-06-09 09:12

【摘要】：兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)为杯状病毒科的重要成员,对多个品种兔均具有高度致病性和致死性。长期以来,由于缺乏稳定的体外培养细胞系,RHDV生命过程中的许多分子机制尚不清楚。核仁素(Nucleolin,NCL)为宿主重要的多功能蛋白,我们前期的研究发现NCL可能参与RHDV的生命过程。鉴于此,本论文综合利用分子生物学方法和基因工程技术,系统研究了NCL在RHDV感染和复制中的作用及其分子机制。主要研究内容如下:(1)利用抑制剂及siRNA干扰技术,我们发现NCL在RHDV内化过程中发挥关键作用。然后,我们证明了NCL通过其N端结构域与RHDV衣壳蛋白(VP60)的保守区域DVN肽(~(472)Asp-Val-Asn~(474))段特异性的相互作用。随后,利用人工合成的DVN肽阻断VP60与NCL之间的结合后,病毒的内化效率明显降低。此外,本研究还发现NCL与网格蛋白轻链(Clathrin light chain A,CLTA)特异性结合,进而参与网格蛋白依赖的内吞作用。动物实验结果表明,DVN多肽可以保护大部分实验兔免受RHDV感染。上述研究结果表明NCL通过网格蛋白依赖的内吞作用介导RHDV的内化过程。(2)利用RHDV复制子系统和蛋白亲和纯化技术,我们成功分离并鉴定了RHDV复制复合物(RC)的主要成分,发现NCL与病毒蛋白(RdRp、p16和p23)参与病毒RC的形成。随后,我们证明了RdRp与病毒其他非结构蛋白不存在相互作用,而是通过NCL间接结合p16和p23病毒蛋白以及其他宿主蛋白,进而形成RC。同时,我们成功鉴定了RdRp、p16和p23与NCL相互作用的活性区域分别位于RdRp(第448-478位肽段)、p16(~(35)Cys-Ile-Arg-Ala~(38)肽段)和p23(第90-145位肽段)。此外,利用人工合成的RdRp多肽和p16多肽阻断NCL与病毒非结构蛋白的结合,我们发现RHDV的复制水平均显著降低。上述研究结果表明,NCL在RHDV RC的形成过程中发挥关键的桥梁作用。(3)我们发现RHDV感染后宿主NCL的转录水平显著提高,而蛋白水平并无明显变化。同时,我们发现NCL通过与组蛋白去乙酰化酶2(Histone deacetylase 2,HDAC2)结合,发生去乙酰化,随之被泛素化降解。我们还发现HDAC2对RHDV具有抗病毒作用,病毒的复制水平与HDAC2的活性呈负相关性。此外,本研究还发现RHDV利用p16与HDAC2特异性结合降低HDAC2的去乙酰化酶活性。以上结果表明,HDAC2通过诱使NCL去乙酰化,导致其被泛素化途径降解,进而抑制RHDV的复制,而RHDV则利用p16蛋白拮抗HDAC2的抗病毒作用。综上所述,本论文首次发现RHDV通过劫持NCL完成入侵细胞的内化过程。同时,我们还发现NCL在RHDV复制复合体的形成过程中发挥关键的桥梁作用。此外,本研究还发现宿主蛋白HDAC2对RHDV具有抗病毒作用。上述研究成果使我们进一步认识了RHDV感染和复制的分子机制,为该病毒的防控提供了重要的理论基础。
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国农业科学院博士学位论文 第 章 引 2010 年开始在欧洲爆发并逐渐流行的新型兔出血症病毒（RHDV2）属于 GI.2 基因型all-Recule et al., 2011)。GI.1 和 GI.2 两个基因型的 RHDV 没有交叉免疫原性，因此在欧洲 RHD经逐渐取代经典 RHDV 成为优势流行毒株(谭永贵等, 2016)。

国农业科学院博士学位论文 第 章 引病毒对理化因素具有较强的抵抗力，杜念兴等(杜念兴等, 1986)发现，RHDV 对热（60℃in），对酸（pH 3.0）稳定，能耐乙醚、氯仿等有机溶剂的处理，，对 1M 的氯化镁等化学试具有较强的抵抗力。20%甲醛溶液作用 2.5 h，10%的漂白粉消毒液作用 2-3 h 以及 1% 氢消毒液作用 3-4 h 能够完全杀灭该病毒，而生石灰和过氧乙酸类消毒液对 RHDV 杀灭效果
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.291


本文编号：2704467