大肠杆菌、沙门氏菌中重金属抗性基因分布及共同耐药大肠杆菌E308的全基因组测序

发布时间：2020-06-09 10:33

【摘要】：为了研究大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)中重金属抗性基因流行情况及大肠杆菌、沙门氏菌中重金属抗性基因与抗生素、季铵盐(Quaternary ammonium compounds,QACs)消毒剂的耐药表型和耐药基因型的相关性,检测了肉鸡养殖场中分离的79株大肠杆菌、132株沙门氏菌,肉中分离的99株大肠杆菌、162株沙门氏菌中重金属抗性基因,并根据检测的基因型,测定了重金属对菌株的最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentrations,MICs),分析了大肠杆菌、沙门氏菌中重金属抗性基因与抗生素、消毒剂的耐药表型及基因型相关性。选择了一株对重金属、抗生素及消毒剂同时具有抗性的大肠杆菌E308进行全基因测序,获得了该菌株完整的基因组序列。在大肠杆菌、沙门氏菌中共检测出9种重金属抗性基因。在大肠杆菌中,基因zntA(表达对Zn的抗性)检出率最高(P=77.0%),而zntB(表达对Zn的抗性)的检出率最低(P=0.6%),zntA-rcnA基因组合在大肠杆菌中最高(P=11.8%),其次为arsB-zntA-rcnA(P=10.7%)、pcoR-zntA-rcnA(P=8.4%)。肉源大肠杆菌中arsB(表达对As的抗性)和merA(表达对Hg的抗性)的检出率显著高于鸡场源大肠杆菌中的检出率(p0.05)。重金属对大肠杆菌的MICs范围为≤12.5mg/L—1600 mg/L。其中,Hg~(2+)对大肠杆菌的MICs最小(≤12.5 mg/L),Zn~(2+)、Mn~(2+)对大肠杆菌MICs最高(1600 mg/L)。在沙门氏菌中,zntB抗性基因检出率最高(P=87.1%),而zntA的检出率最低(P=0.3%),基因型chrA-zntB在沙门氏菌中检出率最高(P=19.4%),其次为zntB(P=14.6%)、pcoR-chrA-zntB(P=6.5%),27株沙门氏菌未检出任何重金属抗性基因(P=9.2%)。鸡场源沙门氏菌中的arsB检出率显着高于肉源沙门氏菌(p0.05)。沙门氏菌对重金属的MICs范围为≤12.5 mg/L—1600 mg/L。沙门氏菌对Hg~(2+)的MICs最小(≤12.5 mg/L),而沙门氏菌对Cu~(2+)、Zn~(2+)以及Mn~(2+)的MICs最高(1600 mg/L)。在大肠杆菌中,重金属抗性基因arsB与抗生素耐药性存在相关性(p0.05),但未发现重金属抗性基因和抗生素耐药基因存在相关性。重金属抗性基因arsB和zntA与苯扎氯铵(Benzalkonium chloride,BC)耐药性存在显著相关性(p0.01),重金属抗性基因arsB和pcoR与十六烷基氯化吡啶(Cetylpyridinium chloride,CPC)耐药性存在显著相关性(p0.01)。重金属抗性基因arsB、merA、pcoR(表达对Cu的抗性)、zntA、chrA(表达对Cr的抗性)与消毒剂耐药基因存在显著相关性(p0.05)。在沙门氏菌中,pcoR和pcoC(表达对Cu的抗性)与抗生素耐药性存在相关性(p0.05),重金属抗性基因均与β-内酰胺类、四环素类、磺胺类、喹诺酮类以及氨基糖苷类抗生素耐药基因存在相关性(p0.05)。在沙门氏菌中,arsB、chrA与消毒剂BC耐药性具有相关性(p0.05)。重金属抗性基因arsB、chrA与BC、CPC耐药性具有相关性(p0.01),消毒剂耐药基因qacEΔ1耐药基因与arsB、pcoR和pcoA存在极显著相关性(p0.001)。通过对大肠杆菌E308全基因组测得的序列进行组装,最终获得10个contigs,组装的contigs总长度为5,350,144 bp。对基因组编码基因预测,注释得到5,155个基因,其注释的基因总长为4,484,934 bp,占总序列的86.81%。通过组装获得一个长度为4,786,360 bp的环状染色体序列,GC含量为50.76%,共预测得到4,658个基因。同时,组装获得四个环状质粒序列,分别命名为pLKSZ01,pLKSZ02,pLKSZ03及pLKSZ04,序列大小分别为111,721bp、113,645 bp、61,476 bp、92,978bp,质粒类型分别为IncI1,IncF2,IncI2,p0111。通过对染色体基因序列进行比对,发现大量编码抗生素、消毒剂、重金属抗性基因以及大量可移动遗传元件(Mobile genetic elements,MGEs)。其中,大多数属于多重耐药外排泵(Multidrug resistance efflux pump,MDR pump)系统。质粒pLKSZ01序列包括了插入序列(Insertion sequences,ISs)、转座子、接合转移区域以及编码大肠菌素1A、大肠菌素1A免疫蛋白、大肠菌素M免疫蛋白的基因。质粒pLKSZ02的可变区包含了12个抗生素耐药基因(blaCTX-M-55、oqxA、oqxB、fosA3、floR、tetA、tetR、strA、strB、sul2、aph(3’’)-II及blaTEM-1)以及大量的ISs。质粒pLKSZ03包含了一个长的IV型菌毛(Type IV pilus,T4Ps)组装系统、IV型分泌系统(Type IV secretion system,T4SSs)以及携带一个mcr-1基因(表达对多粘菌素的耐药性)。质粒pLKSZ04携带了8个抗生素耐药基因、1个消毒剂耐药基因以及1个重金属Cr抗性基因(blaTEM-1,dfrA1,aadA2,qacEΔ1,sul1,chrA,mphA,mphR,tetR,tetA)。结果表明,重金属抗性基因在大肠杆菌及沙门氏菌中普遍存在,大肠杆菌及沙门氏菌中重金属抗性基因与抗生素耐药性、消毒剂耐药性存在相关性。在大肠杆菌的染色体上存在着大量的重金属抗性基因以及消毒剂、抗生素耐药基因,可能使大肠杆菌同时产生对重金属、消毒剂、抗生素抗性。质粒上携带着大量的抗生素耐药基因,部分耐药基因还能够介导对消毒剂的耐药性,同时对铬(Cr)表达抗性的基因也有发现,表明细菌对三者的抗性基因可能会在细菌之间进行传播,导致细菌对重金属、消毒剂和抗生素的共同耐药。因此,加强畜禽养殖环境中重金属的管理,对控制重金属、抗生素、消毒剂共同耐药菌株的出现以及传播有重要意义。
【图文】：

基因组,染色体基因,外圈,内圈

33图 3-1 大肠杆菌 E308 染色体基因组Figure 3-1 The chromosome genome of E. coli E308注：从外圈至内圈，1、2 圈为编码基因，3、4 圈为 eggNOG，4、5 圈为 KEGG，7、8 圈为GO，9、10 圈为 ncRNA，，11、12 圈为基因组 GC 含量，13、14 圈为基因组 GC skew 值分布

质粒,功能注释,基因组,基因

图 3-3 质粒 pLKSZ01 基因组Figure 3-3 The genome of plasmid pLKSZ01注：最外圈是质粒上基因名或编码蛋白类型，由外到里，分别是 COG 功能注释分类基因、基因组序列位置坐标、基因组 GC 含量、基因组 GC skew 值分布。通过 BLASTN 比对表明，pLKSZ01 序列大约 84kb 序列和其它 IncI1 存在高度相关性（>95%），比如 p931IncI1（CP016387）、pTF2（KJ563250）、pTFH18（KM052220）以及 pC23-89 （KJ484639 ）。在质粒 pTF2、pTFH18以及 pC23-89 携带 bla-TEM 抗生素耐药基因，而质粒 pLKSZ01 没有携带抗生素耐药基因（图 3-4）。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61

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