马尔堡病毒病毒样颗粒和表达马尔堡病毒GP重组狂犬病病毒的构建及实验免疫研究

发布时间：2020-06-09 11:08

【摘要】：马尔堡出血热(MHF)是由马尔堡病毒(MARV)引起的一种急性、烈性出血性人兽共患传染病,目前尚无有效的疫苗和治疗药物。此外,由于MARV属于生物安全四级病原体,进一步阻碍了其传统疫苗的研发。因此,研制安全、有效的新型疫苗对于应对MHF的暴发流行和可能的生物恐怖袭击均具有重要意义。病毒样颗粒(VLPs)不含病毒核酸,无感染或复制能力,安全性高,形态结构与天然病毒相似,可诱导机体产生良好的细胞免疫和体液免疫应答反应,是当前基因工程疫苗研究的热点。基于VLP制备的乙型肝炎病毒(HBV)、人乳头状瘤病毒(HPV)等多种新型疫苗均已成功上市。近年来,随着研究的深入,病毒载体疫苗在烈性传染病的防控中发挥着重要作用。狂犬病病毒(RABV)作为疫苗载体具有基因组简单、可稳定表达外源蛋白、允许插入多个大片段的外源基因且并不影响病毒自身复制、病毒基因组不会整合到宿主基因组等优点。本论文利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac/IC)构建并制备MARV VLPs,同时以狂犬病病毒SRV9株为载体,构建表达MARV GP的重组狂犬病病毒,分别以小鼠、马和非人灵长类等动物评价其安全性和免疫原性,为研制安全、高效的MARV新型疫苗奠定基础。利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统构建表达MARV糖蛋白(GP)和基质蛋白(VP40)的重组杆状病毒,基因组PCR、间接免疫荧光和Western Blot等方法鉴定结果表明:拯救的重组杆状病毒可成功表达MARV GP和VP40蛋白。将获得的重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞成功获得了MARV VLPs,透射电镜观察表明:VLPs与MARV天然结构相似,具有典型的丝状结构,大小约为600-1000nm。利用超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心等方法纯化MARV VLPs,辅以(单独或联合使用)佐剂(茯苓多糖[PCP-II]、聚肌胞苷[PloyI/C]和铝胶[Alum])制备免疫原,以小鼠和猴评价其免疫效果。小鼠试验结果表明:MARV VLPs成功诱导小鼠机体产生特异性中和抗体和细胞免疫应答。3种免疫佐剂中PCP-II的效果明显优于其他组,可诱导机体产生显著高的抗MARV抗体、B淋巴细胞、T淋巴细胞和细胞因子分泌。猴试验结果显示:MARV VLPs免疫恒河猴后可刺激机体产生抗MARV抗体,ELISA抗体效价可达1:1280,病毒中和抗体效价可达1:320。MARV VLPs免疫组恒河猴的外周血淋巴细胞(PBMCs)可分泌显著增多的IFN-γTh1型细胞因子和IL-4 Th2型细胞因子。以上结果表明,MARV VLPs联合PCP-II佐剂在对小鼠和恒河猴具有良好的免疫效果,可诱导机体产生特异性体液免疫应答与细胞免疫应答。抗血清疗法是治疗病毒和细菌等感染的快速、经济和有效手段,将纯化的MARV VLP辅以佐剂免疫健康马匹,成功制备了马抗MARV高免血清和精制免疫球蛋白F(ab')_2。马抗MARV高免血清的ELISA抗体效价可达1:20480,中和抗体效价可达1:640;马抗MARV IgG和精制免疫球蛋白F(ab')_2对MARV假病毒的半数效应浓度(EC_(50))分别为0.316 mg/mL和10 mg/mL。基于本实验室建立的狂犬病病毒SRV9株反向遗传操作平台,将MARV的G基因插入狂犬病病毒SRV9株的P-M基因之间,成功拯救获得了表达MARV G蛋白的重组狂犬病病毒rSRV9-MGP。直接免疫荧光和Western-blot鉴定结果表明:重组病毒rSRV9-MGP可成功表达MARV G蛋白。rSRV9-MGP可在BSR细胞上高效稳定复制,病毒滴度最高可达10~8 FFU/mL,且MARV G基因的插入不影响重组狂犬病病毒rSRV9-MGP的复制和生长。与母本毒株rSRV9相比,重组狂犬病病毒rSRV9-MGP对小鼠的致病性未增强。为评价重组病毒的免疫原性,将母本病毒rSRV9和重组病毒rSRV9-MGP灭活后,单独免疫或混合佐剂免疫成年小鼠,结果表明:重组病毒rSRV9-MGP可同时诱导机体产生抗RABV和MARV的中和抗体;PCP-II佐剂组小鼠的特异性中和抗体水平和细胞免疫应答反应均优于其他组。综上所述,本研究制备的MARV VLPs和表达MARV GP重组狂犬病病毒可成功刺激机体产生特异性体液免疫和细胞免疫应答,为进一步研制针对MARV的新型疫苗提供了技术支持和物质储备。
【图文】：

粒子结构,电镜,图片,示意图

尔堡病毒分类及形态结构RV 为单股 RNA 病毒，只有单一种属，以前称为维多利亚湖马尔堡下观察 MARV 颗粒呈长丝状，有时卷曲，直径大小为 75～80 n1400 nm（图 1）。MARV 基因组长约 19 kb，编码糖蛋白（GP）40）、VP24、NP、VP35、VP30 和 L 7 种病毒结构蛋白。MAR胞原代细胞、鸡胚成纤维原代细胞、人宫颈癌细胞系 (Hela cell)胞(Vero cell)和幼地鼠肾异倍体细胞等多种组织细胞中培养。基系统发育分析表明，该物种的已知成员至少可以分为五种不同的密切相关，核苷酸序列差异仅为 7％，，而第五种谱系不同，核苷]。由于所有分离株之间的基因组差异低于 30％，又将五种不同 M划分为两种谱系。

示意图,结构蛋白,基因组,示意图

图 2 马尔堡病毒结构蛋白和基因组示意图Fig 2 Schematic representation of marburg virus structural protein and genome1967 年，欧洲首次报道病毒性疾病，通过电子显微镜观察，将其确定致命性病原体。病毒颗粒的异常丝状结构混淆了人们的判断，甚至部分人种疾病的致病因素可能与螺旋形钩端螺旋体有关[4]。另一部分人认为，观颗粒形态与弹状病毒形态相关，并将新发现的病原体以地名命名，RV[5]。MARV 粒子是多形性的颗粒，呈现为棒状、环状、弯曲、六形或构。纯化后病毒颗粒经低温电泳分析显示，Vero 细胞培养的病毒颗粒约丝状，37％为六字形，33％为圆形[6]。同时，研究也揭示了病毒颗粒平均 892 nm，平均直径为 91nm，与以往的常规 EM 研究结果差异较大。常规究显示，MARV 颗粒直径均匀为 80 nm，而平均颗粒长度为 790 nm[7, 8]。异可能是由于冷冻电镜和常规电镜之间的实验差异造成的[6]。值得注意的
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

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