一株黑斑蛙源蛙病毒的分离鉴定及生物学特性研究

发布时间：2020-06-09 21:46

【摘要】：2016年4月,四川双流某黑斑蛙(Rana nigromaculata)养殖场的蝌蚪爆发一种流行性传染病,死亡率近90%,主要临床特征为腹部肿胀,下颌与腹部等体表出血;剖检见腹腔内有淡黄色腹水,肝肿大充血,肠道空虚,腔内充有大量黏液,脾肿大。组织病理学上,患病蝌蚪心、肝、肾、肠与脾等全身多组织器官受损,出现明显的变性与坏死病灶,且在肝细胞与肠上皮等细胞胞浆内发现嗜碱性包涵体。患病蝌蚪组织匀浆液接种鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprini cell line,EPC),25℃恒温培养4d,出现明显的CPE,Reed-Muech法测得其滴度为10~7 TCID_(50)/0.1 mL。用5%浓度的病毒液浸泡8h对健康蝌蚪进行人工感染试验,感染蝌蚪表现出与自然发病蝌蚪相似的症状,死亡率达到80%,证实分离病毒为该病病原。电镜观察发现病毒颗粒为正六边形、有囊膜,对角线直径约135±8nm,在胞质中呈晶格状排列或游离状;主要衣壳蛋白基因(Maior capsid protein,MCP)序列分析表明其与蛙病毒属病毒的相似性在99%以上。综上,判断此次黑斑蛙蝌蚪大量死亡的病原为虹彩病毒科蛙病毒属病毒,将其命名为黑斑蛙蛙病毒(Rana nigromaculata ranavirus,RNRV)。采用常规研究方法,对RNRV的病毒滴度、酸碱敏感性、胰蛋白酶敏感性、有机试剂敏感性、温度敏感性以及病毒最适培养细胞系、最适培养温度、增殖特性等理化特性与表型进行测定。结果显示RNRV具有与蛙病毒属病毒相似的理化特性与表型,其对过酸(pH≤3)、过碱(pH≥10)、有机试剂及胰蛋白酶敏感;60℃作用30min可被灭活;最适培养细胞系为EPC和GCO,最适培养温度范围为25℃-28℃;在25℃条件下感染EPC细胞,12-24h内病毒增殖速度达最大,36h后病毒增殖速度减缓,在72-96 h则进入生长平台期。基于高通量测序技术,采用HiSeq2000测序仪对RNRV进行了全基因组测序。结果显示,该病毒基因组序列全长为104286 bp,包括104个ORFs,其中已知功能的有55个,未知功能的有49个,它们所编码蛋白的氨基酸长度在41-1293AA之间,分子量在4.4-140.8KDa之间,整个基因组GC含量为55.2%,且在基因组序列中的79069-79186bp位置间存在59个CA重复。通过点阵分析发现RNRV基因组与RGV最为相似;以RNRV 26个核心基因编码蛋白的串联氨基酸序列与其他14株虹彩病毒相关序列根据邻近法共同构建系统发育树发现,RNRV归属于蛙病毒属FV3病毒类群,且在进化关系上与分离自中国的RGV、STIV的亲缘关系最近。
【图文】：

蛙病毒,囊膜

质囊膜约厚4nm，其表面镶嵌着内层囊膜蛋白（Intramembranousproteioxvirus）相似，该内层囊膜可能来源自宿主细胞的高尔基体或内质网，配和病毒感染方面参与重要作用[29]；病毒衣壳由衣壳蛋白亚单位排列位主要由主要衣壳蛋白（Major capsid protein，MCP）组成，该蛋白是保守的结构蛋白，大小约为48kDa，一般情况下能占到病毒总蛋白的45%的囊膜位于粒子的最外层，是病毒出芽过程中从宿主细胞的细胞膜释放蛙病毒区别于其他DNA 病毒的一个重要特征，同时囊膜中存在有能够与入侵能力的受体结合蛋白[31]，这对有囊膜病毒对宿主的感染力的提用。蛙病毒在感染宿主细胞时，，通常会在胞浆中形成一片电子密度较浅毒的DNA 与编码好的病毒衣壳蛋白在该区域组装成一个完整的病毒颗粒在胞浆中游离或聚集成整齐的晶格状结构（Paracrystallinearray），该的照射下呈蓝紫色虹彩，故名虹彩病毒，且电子显微镜下的晶格状排列病毒的典型特征之一。

蝌蚪,临床症状

剖检可见腹腔内有淡黄色腹水，肝肿大充血，肠道空虚且腔内充有大量黏液，脾肿大（图2.1 C、D）。患病蝌蚪体表粘液与肠腔内均未检测到寄生虫存在；患病蝌蚪肝脏与腹水的组织涂片，经革兰氏染色后镜检也未观察到细菌。图 2.1 患病蝌蚪临床症状。A、B 为患病蝌蚪体表症状，箭头所示位置可见腹部肿胀，体表多处出血，C、D 为患病蝌蚪剖解病变，箭头所示为肝肿大出血。Fig.2.1 Clinical symptoms of moribund tadpoles. A, B represent symptoms of diseased tadpoles’ bodysurface, the arrowhead area shows swollen abdomen and hemorrhage on body surface. C, D representsymptoms of diseased tadpoles’ inner organs. the arrowhead area shows congestion and swelling of theliver.20
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

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