水牛耐热性和抗热应激方法及耐热基因鉴定研究

发布时间：2020-06-09 17:57

【摘要】：热应激影响动物的生长发育和泌乳,降低生产性能。水牛主要生活在高温高湿气候地区,对高温高湿气候条件具有一定的适应性,但当其暴露在太阳下或在高温天气下劳作时,也会表现不适反应,进而影响生理和生产表现,如呼吸加快,体温升高,繁殖和泌乳性能紊乱等。目前,预防热应激的措施主要包括营养调控,环境改善和遗传改良,其中耐热品种选育是最经济有效的措施。耐热品种的传统选育方法进展缓慢,新兴的高通量测序技术为研究耐热性状提供了新的方向。因此,本研究首先评估水牛抗热应激能力,其次利用高通量测序技术对影响耐热性能的候选基因进行筛选和鉴定,最后进行喷淋水牛的抗热应激效果评估,旨在为提高水牛抗热应激能力,加快高产耐热品种培育提供理论依据和技术支撑。1.水牛耐热性及其影响因素研究(1)水牛耐热性研究分析90头杂交水牛在冬、春和夏季的生理指标、生产性能和血液参数,发现在夏季水牛直肠温度(39.24±0.07°C)、呼吸频率(69.74±3.82次/分钟)、体表温度(38.01±0.09°C)及血浆HSP70(421.28±53.11pg/mL)和HSP90(3348.48±306.44pg/mL)水平显著性高于春季(38.34±0.03°C、15.76±0.62次/分钟、35.44±0.35°C、263.65±31.36 pg/mL和1311.08±222.51pg/mL)和冬季(38.13±0.05°C、10.49±0.16次/分钟、24.51±0.24°C、174.11±53.13pg/mL和947.21±230.00pg/mL);在夏季的受胎率(28.27%)、排卵卵泡直径(10.36±0.26mm)、大卵泡直径(10.22±0.24mm)、排卵卵泡个数(0.71±0.07)和大卵泡个数(0.79±0.06)显著性低于春季(32.35%、11.77±0.30mm、11.59±0.29mm、0.76±0.09和0.85±0.07)和冬季(35.48%、12.58±0.32mm、12.46±0.31mm、0.84±0.08和0.90±0.07)。在夏季,水牛的呼吸频率(r=0.84)和直肠温度(r=0.81)与温湿度指数(THI)显著性正相关,当THI高于78时,水牛呼吸频率和直肠温度呈显著上升趋势,说明水牛的耐热性较奶牛强。(2)纯种和杂交水牛耐热性比较当THI大于78时,比较夏季14头纯种地中海水牛和30头杂交水牛的生理指标和血液参数,发现杂交水牛的直肠温度(39.12±0.09°C)、呼吸频率(60.82±5.45次/分钟)和体表温度(37.81±0.12°C)显著性低于纯种水牛(39.38±0.09°C、76.84±4.31次/分钟和38.23±0.12°C);血浆HSP90(2938±520.73pg/mL)、HSP70(375.12±64.47pg/mL)和皮质醇(214.06±22.83ng/mL)水平显著性高于纯种水牛(1381.61±339.00pg/mL、202.11±39.45pg/mL和145.45±19.96ng/mL)。说明杂交水牛的耐热性强于纯种地中海水牛。(3)犊牛和成年水牛耐热性比较当THI大于78时,比较夏季15头犊牛(3月龄)和30头成年水牛(12月龄)的生理指标和血液参数,发现成年水牛的直肠温度(39.12±0.09°C)、呼吸频率(60.82±5.45次/分钟)和体表温度(37.81±0.12°C)显著性低于犊牛(39.46±0.09°C、98.72±7.21次/分钟和38.92±0.12°C);血浆HSP90(2938±520.73pg/mL)、HSP70(375.12±64.47pg/mL)和皮质醇(214.06±22.83ng/mL)水平显著性高于犊牛(1098.81±391.23pg/mL、172.11±27.15pg/mL和128.25±21.36ng/mL)。说明成年水牛的耐热性强于犊牛。(4)泌乳高产和低产水牛耐热性比较当THI大于78时,比较夏季16头高产泌乳水牛(8~12Kg)和12头低产泌乳水牛(4Kg)的生理指标和血液参数,发现低产水牛的直肠温度(38.86±0.07°C)和呼吸频率(56.52±7.36次/分钟)显著性低于高产水牛(39.21±0.07°C和84.72±3.61次/分钟);血浆HSP90(2723±413.33pg/mL)和HSP70(357.14±34.53pg/mL)水平显著性高于高产水牛(1278.21±278.00pg/mL和176.17±29.13pg/mL)。说明低产水牛的耐热性强于高产水牛。(5)妊娠晚期与空怀水牛耐热性比较当THI大于78时,比较夏季8头妊娠晚期水牛和17头空怀水牛的生理指标和血液参数,发现空怀水牛的直肠温度(39.03±0.05°C)、呼吸频率(56.62±7.35次/分钟)和体表温度(37.91±0.14°C)显著性低于妊娠晚期水牛(39.46±0.05°C、106.23±6.47次/分钟和38.77±0.14°C);血浆HSP90(3458±478.23pg/mL)和HSP70(359.17±58.39pg/mL)水平显著性高于妊娠晚期水牛(1419.27±279.00pg/mL和237.15±25.47pg/mL)。说明空怀水牛的耐热性强于妊娠晚期水牛。2.水牛耐热基因发掘与鉴定(1)耐热和热敏感杂交水牛和奶牛的筛选在夏季(THI78)连续5天检测30头杂交水牛的生理指标和血液参数,获得耐热和热敏感水牛各4头。耐热水牛在夏季的直肠温度和呼吸频率分别为38.72±0.10°C和41.67±4.43次/分钟,显著低于热敏感水牛(39.67±0.06°C、100.12±3.48次/分钟);血浆HSP70、HSP90和皮质醇水平分别为454.26±91.15pg/mL、3972.53±668.49pg/mL和251.64±10.68ng/mL,显著高于热敏感水牛(142.86±41.35pg/mL、845.42±236.96pg/mL和121.46±24.20ng/mL)。在夏季连续7天检测42头高产荷斯坦奶牛的生理指标、血液参数和产奶量变化,获得耐热和热敏感奶牛各3头。耐热奶牛在夏季的直肠温度和呼吸频率分别为38.7±0.02°C和57±1次/分钟,显著低于热敏感奶牛(39.7±0.05°C、100±6次/分钟);血浆HSP70、HSP90和皮质醇水平分别为391±59pg/mL、2747±196pg/mL和247±19 ng/mL,显著高于热敏感奶牛(183±12pg/mL、1075±84pg/mL和144±11 ng/mL)。(2)耐热和热敏感水牛血液转录组分析应用mRNA-Seq和miRNA-Seq方法分析耐热和热敏感水牛血液转录组,共鉴定出753个差异基因和16个差异miRNA。应用加权基因共表达网络分析(WGCNA)方法,将差异基因分为5个模块,其中4个模块与热应激指标相关。在turquoise模块中,发现6个与耐热性相关的基因(IL18RAP、IL6R、CCR1、PPBP、IL1B和IL1R1),且差异miRNA bta-miR-1246靶向结合ABCC4基因与枢纽基因构建mRNA-miRNA网络图,进而调控水牛热应激反应。应用mRNA-Seq方法分析耐热和热敏感奶牛血液转录组,共鉴定出200个差异表达基因。其中,14个基因参与到蛋白互作(PPI)网络,4个与耐热性相关的基因(OAS2、MX2、IFIT5和TGFB2)富集到免疫效应过程。整合分析水牛和奶牛耐热性相关的差异基因,发现7个(BMP4、DIRAS2、CD72、DOCK5、MOV10L1、NAT14和TSPAN15)共有的且表达趋势一致的基因。以上结果为进一步探讨水牛的耐热机制奠定了基础。(3)耐热基因BMP4的解析取奶牛乳腺上皮细胞,用RNAi技术敲低水牛和奶牛共有的耐热基因BMP4的表达,然后进行热应激(42℃,3小时)处理,检测细胞的增殖和凋亡率及HSP70、HSP27、Bax和Bcl-2基因的表达。结果表明,敲低组的细胞早期凋亡率明显增加,但基因HSP70、HSP27、Bax和Bcl-2的表达水平没有显著差异。推测该基因的上调可能是通过其他途径来增强水牛耐热性。3.喷淋水牛的抗热应激效果当THI大于78时,比较不同喷淋方法对30头泌乳水牛的体温和体表温度及乳成分的影响,发现从喷淋后水牛乳品质、体温和体表温度的变化及节水减污的角度考虑,实际生产中建议采用间隔14分钟喷淋时长1分钟的方案。
【图文】：

流程图,试验设计,流程图,牛舍

图 1-1 试验设计流程图Figure 1-1 Experimental Design Flow ChartGPG: Ovsynch 同期发情方案，，即 GnRH, PG, GnRH.2.3.2 牛舍温、湿度测定分别在牛舍两端和中部距离地面 1.5 米高处悬挂温度湿度测定仪，测定牛舍环境温度和相对湿度，并计算温湿度指数（THI）。测定时间为每天 6:00 am ~ 20:00 pm两个小时记录一次。THI 的计算公式为：THI= (1.8×AT+32)-(0.55-0.0055×RH) ×(1.8×AT-26) (Kendall and Webster 2009)式中 AT 和 RH 分别代表环境温度和相对湿度。2.3.3 生理指标测定呼吸频率：于 11:40-14:00 观察并记录试验水牛每分钟的腹部起伏次数，每头牛连续测量 3 次，取三次平均值。

趋势图,直肠温度,差异显著,呼吸频率

参数ParametersCrossbred Buffalo春 (n=34)Spring夏 (n=25)Summer冬 (n=31)WinterTHI 68.11 ±0.20a82.95 ±0.77b49.10 ±0.50cRT (°C) 38.34 ±0.03a39.24 ±0.07b38.13 ±0.05cRR(breaths/min) 15.76 ±0.62a69.74 ±3.82b10.49 ±0.16aBT (°C) 35.44 ±0.35a38.01 ±0.09b24.51 ±0.24cHSP70 (pg/mL) 263.65 ±31.36a421.28 ±53.11b174.11 ±53.13aHSP90 (pg/mL) 1311.08±222.51a3348.48±306.44b947.21±230.00aConception rate (%) 32.35a28.27b35.48cDiameter in ovalutory follicles (mm) 11.77±0.30a10.36±0.26b12.58±0.32cDiameter in biggest follicles (mm) 11.59±0.29a10.22±0.24b12.46±0.31cNO. in biggest follicles 0.85±0.07a0.79±0.06b0.90±0.07cNO. in ovalutory follicles 0.76±0.09a0.71±0.07b0.84±0.08ca, b 和 c：同行不同上标字母代表差异显著（p < 0.05）a, b and c: The different superscripts within different season groups show significant difference (p <0.05).
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S823.83

【参考文献】