布鲁氏菌BtpB缺失株构建及其对山羊肺泡巨噬细胞NLRP3炎性体的影响

发布时间：2020-06-09 16:22

【摘要】：布鲁氏菌感染引起的布鲁氏菌病是严重危害我国奶业发展的人兽共患病,由于缺乏安全可靠的疫苗和鉴别诊断手段,一直备受人们关注。深入揭示布鲁氏菌的致病机制,是研发新疫苗和有效防控手段的关键,也是该病目前研究的热点。布鲁氏菌以肺泡巨噬细胞为靶细胞,在其中复制并干扰巨噬细胞的功能。布鲁氏菌有多种免疫逃避机制,干扰模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs)的识别是其隐秘进入宿主细胞及抑制固有免疫反应的关键。BtpB是依赖布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统分泌的一种效应分子,也是目前已知的主要毒力因子之一。NLRP3(NOD-like receptor family member pyrin domain-containing protein 3)作为一种胞内模式识别受体,在病原体入侵的固有免疫反应中发挥重要作用,由其装配形成的NLRP3炎性体是一种存在于胞浆中的大分子多蛋白复合物,能够感知病原微生物感染、组织损伤和代谢失衡时所释放的分子信号。NLRP3激活后促进IL-1β等炎性因子的成熟和释放,促进多种免疫相关基因的表达,并募集淋巴细胞至感染部位,从而抑制病原微生物感染。研究表明,布鲁氏菌感染期间,其Ⅳ型分泌系统效应分子BtpB能以多种方式干扰宿主的天然免疫应答,其中干扰TLRs信号传导,进而抑制下游免疫级联反应是主要方式之一。模式识别受体感受病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)后会引发NLRP3炎性体的激活,然而BtpB作为布鲁氏菌的TIR结构域蛋白与NLRP3炎性体之间的关系仍不清楚,其发挥免疫调节功能的机制也有待进一步研究。为揭示IV型分泌系统效应分子BtpB与布鲁氏菌生长表型及其与NLRP3炎性体活化的关系。本研究通过基因编辑技术构建布鲁氏菌S2株(B.suis S2)BtpB缺失株及其互补株;经扫描电镜观察B.suis S2、BtpB缺失株和互补株的菌体形态,测定生长曲线,及其在酸、热、高渗、氧压力等应激条件下生存率等差别,检测BtpB对布鲁氏菌生长特性的影响;通过细胞试验,利用qRT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光等相关技术检测BtpB对B.suis S2侵染山羊肺泡巨噬细胞后模式识别受体、NLRP3炎性体组分以及相关炎性因子表达的影响。试验结果如下:1.分别以复苏的B.suis S2和pBBR1MCS5为模板,PCR扩增BtpB上下游同源臂和庆大霉素基因,将三段扩增产物连接到pUC19载体上,构建重组质粒pUC19G-BtpB。酶切、测序鉴定正确后,电击转入B.suis S2感受态细胞。经庆大霉素抗性筛选、PCR鉴定获得BtpB缺失株。PCR扩增BtpB基因,将其连接到表达载体pBB-PZT1上,构建重组质粒pBB-PZT1-BtpB。测序正确后,将其电击转入BtpB缺失株感受态细胞中,利用羧苄抗性筛选阳性克隆,经Western blot鉴定正确后获得BtpB互补株。2.扫描电镜观察B.suis S2、BtpB缺失株和互补株的形态,发现BtpB对布鲁氏菌形态无显著影响。通过检测B.suis S2、BtpB缺失株和互补株的生长曲线及其在山羊肺泡巨噬细胞内的增殖,发现三株菌的胞外及胞内增殖曲线均无显著差异。测定在酸、热、高渗、氧压力等应激条件下三个菌株的生存率,发现与原始菌株和BtpB基因互补株相比,缺失株在氧化应激条件下生存率增加。3.通过qRT-PCR、免疫荧光、Western blot和ELISA检测发现:BtpB缺失株处理组,GAMs细胞TLR2、TLR4表达量上调,与B.suis S2处理组和互补株处理组相比,差异显著;BtpB缺失株处理组NLRP3炎性体相关组分NLRP3、ASC和caspase-1表达量显著升高;同时,NLRP3炎性体下游细胞因子IL-1β表达量显著增加,差异极显著。以上结果表明,BtpB对布鲁氏菌S2株生长特性无显著影响,在布鲁氏菌抑制宿主固有免疫的过程中可能通过NLRP3炎性体途径发挥作用。
【图文】：

基因组序列,布鲁氏菌,预测模型

第一章布鲁氏菌分泌系统与 NLRP3 炎性体研究进展鲁氏菌Ⅳ型分泌系统desan 等人（2016）利用 KEGG 数据库对 39 个完整的布鲁氏菌基因组序列进析，，如图 1-1 所示，发现布鲁氏菌中存在三种分泌系统，T1SS、T4SS、T5SS。蛋白质直接从细胞质转运到细胞外环境。主要参与 RTX（repeats-in-toxin）蛋蛋白酶、细胞表层蛋白、脂肪酶等细胞毒素的分泌，也参与非蛋白底物，如葡聚糖和多糖的分泌。布鲁氏菌中 ABC 转运系统可能是最常见及最广泛的主统。T4SS 由一个多蛋白复合物组成，该复合物直接将蛋白质分泌到宿主细泌的蛋白质被称为 IV 型分泌效应分子（type Ⅳ secretion effectors，T4SEs），氏菌的存活及其在受感染宿主细胞中的复制都是必不可少。T5SS 使用 S径将未折叠蛋白质从细胞质膜转移到周质，然后通过外膜复合物向细胞外分arasubramanianet al. 2016）。在这三种分泌系统中，由于 T4SS 对布鲁氏菌的活和调节宿主的免疫反应起重要作用，因此得到了广泛研究。

蛋白结构,布鲁氏菌

l et al. 2008）和肠道沙门氏菌的 TlpA（Newmanet al. 2006），布鲁氏菌 TI白包括 BtpA/TcpB 和 BtpB（Salcedo et al. 2013；Salcedo et al. 2008）。BtpA abortus 2308，B.abortus 9-941 和 B. melitensis 16 M 中，但不存在于 B. su suis S2 中，而 BtpB 存在于所有已测序的布鲁氏菌菌株中。近年来研究发现pB 作为布鲁氏菌重要的毒力因子，在逃避宿主免疫应答的过程中发挥重要.2 BtpB 的结构特点BtpB 是依赖布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统分泌的效应分子，与真核细胞 TIR 结构源性（Newman et al. 2006）。探索 BtpB 结构域发现，在 N 末端含有螺旋束参与同源二聚化，为特异性的磷脂酰肌醇磷酸酯的结合结构域；在 C 末端域（aa 144-256），属于细菌 TLRs 的 Pfam家族中的 TIR-2。TIR 结构域由中行 β-折叠（βA-βE），四周由五个螺旋（αA-αE）和连接环包围。BB 环连接旋 αB，在介导蛋白质-蛋白质相互作用的特异性中起重要作用（Spear et al. 2分 DD 环和 EE 环残基侧链隐藏在二聚体的结构内部。A
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.4

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