β-羟丁酸通过GPR109A-mTOR信号通路调节奶牛NETs的机制

发布时间：2020-06-10 03:20

【摘要】：嗜中性粒细胞抵抗入侵微生物途径之一是通过嗜中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)介导完成的。NETs是新近发现的一种先天性免疫细胞胞外防御机制,存在于大多数免疫细胞中,如巨噬细胞、单核细胞和肥大细胞等。以自身DNA和组蛋白及多种杀灭病原的颗粒蛋白组成的纤维网状结构,可以捕获甚至杀灭细菌、真菌或病毒等。奶牛酮病是围产期奶牛高发代谢性疾病,其特点就是高酮血症。酮病增加了奶牛围产期疾病发病风险,尤其是脂肪肝、皱胃变位、乳房炎、子宫内膜炎等基础性疾病的风险。一般认为与酮病造成的先天免疫机能的抑制有关。近期研究表明,体外β-羟丁酸(BHBA)处理的中性粒细胞,可以使大肠杆菌诱导中性粒细胞胞外诱捕网减少10倍,抑制抗菌活性。但酮病奶牛的高酮血症对中性粒细胞NETs的产生又有何影响?BHBA是通过何种信号通路机制调节中性粒细胞NETs产生的,目前还不清楚。首先,研究酮病奶牛在高酮血症条件下中性粒细胞NETs的状态。激光共聚焦显微镜观察表明,分离的酮病奶牛中性粒细胞可以向细胞外释放纤维状结构(NETs)。同时针对NETs上的蛋白颗粒进行免疫荧光实验,通过激光共聚焦显微镜观察到乙酰化组蛋白、瓜氨酸组蛋白、髓过氧化物酶(MPO)等在NETs上表达。NETs游离DNA定量,表明酮病奶牛中性粒细胞释放NETs的量均显著高于正常奶牛。Western blotting结果显示,中性粒细胞GPR109A-mTOR信号通路的关键分子表达增加。据此可以认为,酮病奶牛在高酮血症条件下中性粒细胞通过GPR109A-mTOR信号通路自发诱导NETs,致使细胞发生NETosis,可能引起自身免疫反应,而发生先天免疫抑制。其次,借助于激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜确定了体外添加BHBA可以诱导奶牛中性粒细胞NETs产生,且对BHBA具有一定的时间和浓度依赖性;BHBA增加中性粒细胞组蛋白乙酰化和瓜氨酸,诱导奶牛中性粒细胞发生NETosis。免疫荧光实验证实BHBA可以增强奶牛中性粒细胞内自噬的积累,而自噬又可以调控NETs释放。在此基础上,本实验进一步明确GPR109A-mTOR是否可以调节BHBA诱导的中性粒细胞NETs的释放。同时添加GPR109A抑制剂百日咳毒素与BHBA处理中性粒细胞后,与BHBA单独处理组相比较,混合处理组NETs释放量显著下降,其他蛋白颗粒酶活性显著降低,伴随自噬显著降低,NETosis显著减弱。利用流式细胞术证明BHBA可以增强中性粒细胞内ROS,而使用DPI与BHBA混合处理中性粒细胞后,与BHBA单独处理组相比较,除ROS减少外,BHBA诱导奶牛中性粒细胞NETs释放量也显著下降,细胞内自噬积累量显著降低,抑制瓜氨酸组蛋白的表达,抑制NETosis。此外,抑制ROS的产生可下调GPR109A表达;当自噬受到抑制时,细胞内ROS水平均显著降低,这表明ROS同时参与BHBA诱导奶牛中性粒细胞自噬的调节和NETs的释放。综上这些结果证明BHBA可以通过GPR109A-mTOR信号通路调节奶牛中性粒细胞NETs释放,其中的关键点是自噬的潜在功能,而且此过程需要依赖于ROS的产生。最后,针对GPR109A-mTOR信号通路是否在外界病原性刺激时可以调节奶牛中性粒细胞NETs的释放。体外添加BHBA及LPS作用于中性粒细胞,观察GPR109A-mTOR关键分子的表达及NETs释放。结果表明,LPS可以通过GPR109A-mTOR信号通路抑制BHBA诱导的NETs释放,抑制NETosis;而BHBA同样可以通过GPR109A-mTOR信号通路抑制LPS诱导的NETs释放,抑制NETosis。总之,BHBA可以通过GPR109A-mTOR信号通路诱导奶牛NETs产生,引起自身免疫反应,造成先天免疫抑制。BHBA可通过GPR109A-mTOR信号通路抑制LPS诱导的中性粒细胞NETs的释放,降低机体对病原体的抵抗能力。研究结果为揭示酮病奶牛先天免疫抑制的机制和增强围产期奶牛免疫机能提供了理论基础。
【图文】：

中性粒细胞,酮病,产生性,奶牛

第二篇研究内容第一章酮病奶牛中性粒细胞诱导 NETs 产生性粒细胞 NETs 的产生，导致 NETosis，表明高酮血症可诱导中性粒细胞产生NETs。

组蛋白,酮病,中性粒细胞,乙酰化

图 1.2 酮病奶牛中性粒细胞 NETs 上乙酰化组蛋白表达（1000×）Fig 1.2 Acetylation histone expression in neutrophils NETs in cows with ketosis（1000×）
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.23

【参考文献】