银川地区规模化奶牛养殖场环境微生物群落分布及耐药性研究

发布时间：2020-06-10 04:03

【摘要】：背景:随着养殖业的迅速发展,我区每年因奶牛养殖业排放的粪污高达400万吨,奶牛粪便中携带的病原微生物、耐药细菌和耐药基因等,会对奶牛的健康养殖造成威胁,并随着粪便还田利用成为食源性和环境的潜在污染源。目前,奶牛养殖业排放的粪污已经成为严重威胁健康养殖和公共卫生安全的重要源头之一。目的:通过研究明确银川地区规模化奶牛养殖场环境微生物群落多样性及细菌耐药性情况,以期为奶牛养殖业对环境及公共卫生安全影响的风险评估提供依据,为开展病原微生物快速检测技术和粪便无害化处理等相关应用研究提供理论依据。方法:通过采集银川地区规模化奶牛养殖场(简称“奶牛养殖场”)新鲜粪便、堆积粪便、污水和土壤样本,采用16SrDNAV4区测序和宏基因组测序的方法,从宏观的角度对奶牛养殖场环境微生物的群落多样性进行研究;采用经典纯化分离,细菌生化检测和16S rDNA全长测序鉴定的方法从可培养微生物的角度对奶牛养殖场环境可培养细菌的群落多样性进行研究;采用K-B药敏纸片检测和耐药基因PCR检测的方法从耐药表型和基因型的角度对奶牛养殖场环境可培养分离株进行7种临床常用抗菌药(青霉素、丁胺卡那、林可霉素、环丙沙星、多西环素、复方磺胺甲VA唑、红霉素)及15种耐药基因(磺胺类:sul1、sul2、sul3;四环素类:tetA、tetB、teD;氨基糖苷类:aacC4、aaatD;β-内酿胺类:CTX-M、OXA、TEM：喹诺酮类:qnrA、aac(6')-Ib-cr、gyrA)的耐药性研究。结果:(1)基于16S rDNA测序和宏基因组测序技术的研究结果表明,银川地区奶牛养殖场的新鲜粪便、堆积粪便、污水和土壤样本中微生物群落组成丰富且多样,通过16S rDNA测序共注释了 55个门,143个纲,243个目,308个科,553个属,其中Actinobacteria,Firmicutes和Bacteroidetes是优势菌门,占所有细菌群落的70%以上;宏基因组测序共注释了 40个门,76个纲,167个目,373个科,1117个属和3336个种,其中优势门(丰度在1%以上为优势菌)为 Actinobacteria,Bacteroidetes,Chloroflexi,Euryarchaeota,Firmicutes,Proteobacteria和Spirochaetes。进一步研究其微生物组成发现,芽胞杆菌属(Bacillus,棒状杆菌属(Corynebacterium),葡萄球菌属(staphylococcus)等菌属在堆积粪便样本和污水样本中丰度显著高于新鲜粪便和土壤样本。(2)通过分离纯化共获得奶牛养殖场环境可培养细菌629株,经鉴定共获得鉴定株560株,分属于52个属和144个种。其中,336株为革兰氏阳性菌,224株为革兰氏阴性菌,且条件致病菌占83.04%(465/560),进一步对分离的45株大肠埃希氏菌分离株进行了血清学检测,结果表明,优势血清型是0157:H7,所占比例高达40.00%。(3)通过对奶牛养殖场560株鉴定株的耐药性研究结果表明,奶牛养殖场常用的7类抗菌药物耐药率较高,均在50%以上,其中堆积粪便样本的分离株对青霉素和复方磺胺甲VA唑的耐药率达100%,污水样本的分离株对青霉素、林可霉素和复方磺胺甲VA唑耐药率为100%:并且全部分离株皆为多重耐药菌株,其中6耐菌株最多,占38.21%,污水样本中7耐分离株最多,占44.12%。(4)通过对分离株的耐药基因进行PCR检测。结果表明,15种耐药基因均检测阳性,共检测出阳性株249株,其中阳性率最高的为β-内酰胺类TEM基因,达10.71%,最低的是磺胺类药物sul3基因为0.89%,共有115种耐药基因型,且单菌株最多检测出携带9种耐药基因(sull/su13/tetA/tetD/aacC2/aadD/TEM/qnrA/gyrA);基于宏基因组测序结果,共注释了 1138个耐药基因,且堆积粪便样本中的耐药基因注释量差异显著(P0.05)高于新鲜粪便和土壤样本。结论:(1)银川地区规模化奶牛养殖场的新鲜粪便,堆积粪便,污水和土壤样本中微生物群落组成多样且在各样本内丰度存在差异。其中新鲜粪便样本中的优势菌属是拟杆菌属(Bacteroides),密螺旋体属(Treponema),普氏菌属(Prevotella)和梭菌属(Clostridium);在堆积粪便样本中优势菌属是假单胞菌属(Psetudomonas),链霉菌属(Streptomyces)和盐单胞菌属(Halomonas);在污水样本中优势菌属是红育菌属(Rhodoferax),拟杆菌属(Bacteroides),嗜冷杆菌属(Psychrobbacter)和黄杆菌属(Flavobtbacterium);在土壤样本中优势菌属是分枝杆菌属(Mycobacterium),诺卡氏菌(Nocarrdioides),链霉菌属(Streptomyces)和考克氏菌属(Kocuria)。并且新鲜粪便样本和污水样本的微生物群落构成相似,堆积粪便和土壤样本的微生物群落结构相似,但随着分类阶元的降低,样本内的微生物群落组成复杂度随之增加,并且通过16S rDNA V4区测序和宏基因组测序的结果表明堆积粪便和污水中条件致病菌的丰度高于新鲜粪便和土壤样本。(2)基于奶牛养殖场可培养细菌的分离鉴定,共鉴定560株分离株,其中83.04%的分离株为条件致病菌,揭示了银川地区奶牛养殖场粪污中可培养的条件致病菌种类及数量较为丰富,提示养殖场粪污是潜在的病原微生物传播源,对奶牛的健康养殖和人类的餐桌安全造成极大的潜在威胁。(3)银川地区规模化奶牛养殖场的新鲜粪便,堆积粪便,污水和土壤样本中微生物耐药情况严重,对青霉素和复方磺胺甲VA唑两种药物的耐药率高达100%,且560株分离株全部为多重耐药菌株:4种样本中堆积粪便和污水样本的耐药情况最为严峻。(4)银川地区规模化奶牛养殖场环境中耐药基因的组成丰富,在粪污样本(新鲜粪便,堆积粪便和污水)中耐药基因丰度较高,是潜在的耐药基因传播源及储存库,对奶牛和人的健康及环境的安全造成潜在威胁。
【图文】：

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宁夏大学硕士学位论逦第二章基丁？邋１（；Ｓ邋ｒＤＮＡ和宏基因组测序的奶中养殖场环境微生物多样性分析逡逑行回收。使用ＴｒｕＳｅｑ？邋ＤＮＡ邋ＰＣＲ－Ｆｒｅｅ邋Ｓａｍｐｌｅ邋Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ邋Ｋｉｔ建库试剂盒进行文库构建，构逡逑建后的文库利用Ｑｕｂｉｔ和Ｑ－ＰＣＲ进行定量，结果合格后，使用ＨｉＳｅｑ２５００邋ＰＥ２５０进行上机逡逑测序。对测序结果进行数据处理［１气ＯＴＵ聚类和物种注释＿］［＿，样品复杂度分析和多样逡逑品比较分析等（图２－２）。逡逑

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【学位授予单位】：宁夏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.6

【参考文献】