酮病奶牛乳清蛋白和乳脂球膜蛋白差异表达分析

发布时间：2020-06-10 08:49

【摘要】：奶业已成为中国畜牧业的支柱产业。随着奶牛产奶量的不断提高,以及部分奶牛场及农户对奶牛的饲养管理不科学,奶牛代谢疾病也随之增多。奶牛酮病是由产后能量供需不平衡,引起脂肪和碳水化合物代谢紊乱,导致的一种全身功能失调性疾病。可致产奶量减少、奶质变差并影响后代素质,奶牛淘汰率升高等,给畜牧业造成较大的经济损失。为探讨酮病奶牛围产期能量代谢负平衡状态对乳汁蛋白组学的影响,研究酮病奶牛能量代谢负平衡与乳汁蛋白组学变化特征之间的关系,并获得酮病奶牛乳汁蛋白组学图谱,寻找酮病奶牛乳蛋白中的早期监测标志物。本实验通过非标定量(Label-Free)蛋白组学方法,对酮病奶牛乳脂球膜蛋白和乳清蛋白分别进行检测,结合生物信息学分析,获得了奶牛乳汁全蛋白图谱,并分析了酮病对牛乳蛋白组成的影响。随后,选择了炎症相关乳脂球膜蛋白进行ELISA验证。在黑龙江省中部地区某千头奶牛存栏量的集约化牧场,选取60头产前14-21天奶牛收集血液,分娩后每3天于清晨榨乳前收集血液和乳汁一次,跟踪采集至产后第28天。分离乳脂和脱脂乳分别冻存。对血液丙氨酸转氨酶(ALT),天冬氨酸转氨酶(AST),AST/ALT,碱性磷酸酶(ALP),总蛋白质(TP),葡萄糖(GLU),甘油三酯(TG),游离脂肪酸(NEFA)和β羟丁酸(BHBA)进行检测,并将血清BHBA浓度≥1.40 mol/L奶牛分为酮病组,血清BHBA1.40 mol/L奶牛分为对照组,使用酮粉法进行确认。将酮病组和对照组奶牛的乳脂和脱脂乳分别混匀后,分别提取乳脂球膜蛋白和乳清蛋白样品进行蛋白定量、SDS-PAGE电泳和胶内酶切,进行液相色谱-质谱/质谱联用(LC-MS/MS)蛋白组学检测,并进行三次技术重复。搜库后,筛选差异蛋白,进行生物信息学分析。确定了酮病对奶牛乳汁蛋白组学的影响。随后,对炎症相关乳脂球膜蛋白进行ELISA检测。同样根据血清BHBA浓度将奶牛分组。围产期内经历过酮病,血清BHBA水平≥1.40 mol/L的奶牛为酮病组,将围产期无酮病发病史,BHBA1.40 mol/L且没有酮病临床症状的奶牛为对照组,并使用酮粉法进行确认。在酮病组奶牛分娩后的第7-14天,收集酮症发作前的样品为K1组,酮症组奶牛第14-28天的样品为K2。当酮病组奶牛产后超过28天,血液BHBA水平1.40mol/L,收集的样品为K3组,作为酮病恢复后的样品。分娩后7-14天的对照组样品为C1组。在14-28天收集的对照组样品为C2组。分析获得了正常和酮病奶牛产后炎症相关乳脂球膜蛋白变化的规律。蛋白质组学研究结果显示,酮病组的乳脂球膜蛋白组分有402个蛋白上调和308个蛋白下调;乳清蛋白组分有22个蛋白上调和313个乳清蛋白下调。酮病导致了参与运输、信号转导、蛋白转运、囊泡介导的转运,发育成熟和免疫系统反应等生物过程均受到了很大影响。抗生素的生物合成、核糖体、内吞作用、内质网蛋白加工、癌症通路通路改变显著。对酮病奶牛炎症相关乳脂球膜蛋白的检测中发现,C2中的c4b结合蛋白α链(C4BPA),凝血酶原(F2),补体3(C3)和α-1-酸性糖蛋白(ORM1)显著高于K2组(p0.05),而单核细胞分化抗原(CD14)显著降低(p0.05)。K2中的α-inter-α-胰蛋白酶抑制剂重链H4(ITIH4),补体9(C9),F2,α-2-HS-糖蛋白(AHSG)和补体调节蛋白变体4(CD46)显著高于K1(p0.05),而CD14和CD46显著低于K1组(p0.05)。K3组中ITIH4,F2和ORM1显著高于K1组(p0.05),CD14显著低于K1组(p0.05)。K1组的ITIH4,C4BPA,C3和CD46显著高于C1(p0.05),而F2,AHSG和ORM1显著低于C1(p0.05)。K2中的CD14和ORM1显著低于C2中(p0.05),K3组中血清淀粉样蛋白A(SAA)和ORM1在显著低于K2(p0.05)。且NEFA的浓度与BHBA、血液中C3、血液中C9、C3和ORM1水平显著相关。BHBA的浓度与血液中C3,TNFα,血液中C9,CD14,C3,和ORM1水平显著相关,GLU浓度与TNFα和ITIH4水平显著相关。我们发现,酮病时奶牛生产效率降低,能量负平衡导致肝功能受到损害。酮病导致奶牛能量代谢紊乱,乳腺分泌功能降低,乳汁免疫功能降低,部分阐明了能量负平衡导致乳汁蛋白变化的机制。证明奶牛酮病与围产期炎症相关代谢通路存在关系。酮病导致了牛奶中炎症相关乳脂球膜蛋白变化,引发了围产期奶牛乳腺炎症反应。本实验对于将来酮病的预测、预防和诊断,具有重要的意义和应用价值。
【图文】：

围产期奶牛,内分泌系统,主要关系,免疫系统

年的研究结果也支持关于炎症介质和代谢性疾病之间关系的推测。Ohtsuk生脂肪肝时，血液中炎性标志物的浓度升高，而中度和重度脂肪肝奶牛血子(TNF)浓度也显著升高[21]。奶牛围产期发生炎症反应，将导致发生其他的风险升高 8 倍，以及血钙浓度下降，难以再次受孕，首月产奶量下降等[奶牛口服干扰素（IFNα），发现可以导致肝脏发生炎症，并导致了急性期验组奶牛与对照组奶牛相比，其产后两周内的血液酮体浓度显著增高[23]。连续皮下注射 TNFα 七天，导致其肝脏甘油三脂含量升高了 1 倍[24]。因此质代谢可以被炎症反应及炎性细胞因子干扰，这也可能是诱发奶牛酮病和谢性疾病的关键因素。量研究证实，围产期能量负平衡诱发了机体的免疫抑制。能量负平衡减缓能的恢复，泌乳初期的代谢应激加剧了围产期免疫抑制[25]。另外，奶牛在图 1-1 围产期奶牛免疫系统、内分泌系统、代谢系统的主要关系e1-1 The main relationship of immune system，，endocrine system and metabolicperinatal cows

模型图,膜蛋白结构,模型,乳脂

CD 36(或 PAS IV)，嗜乳脂蛋白 (Butyrophilin，BTN)和n，MFG—E8 或 PAS 6/7）。另外两种都是分子量更小的非糖基化关蛋白 (Adipophilin，ADPH)和脂肪酸结合蛋白 (Fatty acid bindi的三层结构理论已经被人们普遍接受。从脂肪球内核向外观察，质网合成的极性脂质和蛋白质组成的单层膜，包裹着脂肪球内核附着在双层膜的内表面的高密度蛋白层；最后才是真正来自乳腺细胞质在高密度蛋白层和外部双膜层之间形成细胞质月牙[37]。Van乳脂球膜结合 2-DE 和 MALDI-TOF 技术，对乳脂球膜上的主要和鉴定，结合最新的研究进展，建立了乳脂球膜蛋白的结构模型（了以前 BTN、ADPH 和 XO/XDH 相连或相邻的推测。构建乳脂图 1-2 乳脂球膜蛋白结构模型Figure 1-2 The structure model of the milk fat pellet membrane
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.23

【参考文献】