FHL3基因调控肌肉生长和肌纤维类型转化的功能研究

发布时间：2020-06-10 17:19

【摘要】：FHL3(Four and a half LIM domain protein 3)属于LIM蛋白质超家族,主要在骨骼肌中表达,能够通过LIM结构域与肌分化因子MyoD、肌动蛋白、细胞周期调节因子等多种蛋白的互作,调控成肌细胞分化、细胞骨架结构、肌细胞的形成以及下游基因的表达。本研究利用实验室前期建立的转FHL3基因小鼠模型,研究了过表达FHL3基因对肌纤维类型转化和肌肉生长的作用,具体研究结果如下:1.对实验室前期获得的F1代转基因小鼠进行了鉴定,完成了3个家系的转FHL3基因小鼠的建系工作,扩繁至第5代。转基因小鼠的后代性别比例均衡,阳性率随传代增加逐步升高,至第5代达到90%以上,外源基因能够稳定遗传。同时,转基因小鼠的产仔能力,与野生型小鼠无显著差异。利用实时定量PCR和Western Blot技术,分析2月龄转基因小鼠的心脏、肝脏、肾脏、肌肉和睾丸组织中FHL3基因的表达变化,结果表明FHL3基因在转基因小鼠的肌肉组织中特异性高表达。2.对转基因鼠的体重增长进行检测,结果显示转基因鼠的初生重与野生型小鼠无显著差异,出生后1~8周的生长速度和肌肉比例极显著高于野生鼠。HE染色和免疫荧光结果显示股四头肌、胫骨前肌、腓肠肌的肌纤维数目增多,横截面积增大、密度减小。ATP酶染色和免疫组化的结果表明腓肠肌中II型快肌纤维增多,I型慢肌纤维减少。对转基因小鼠进行力学测试,结果显示其肌肉拉力增强,耐疲劳能力下降。转基因小鼠心脏大小和重量与野生鼠无异,HE染色显示,转基因小鼠心肌发育正常,心肌尺寸与野生鼠无明显差异,同时发现转基因小鼠心脏中FHL3基因的mRNA水平显著上调表达,但蛋白水平无显著变化。3.对转基因小鼠腓肠肌中FHL3和肌纤维类型相关基因进行了转录水平和蛋白水平的分析。结果显示:在mRNA水平,1、2和3月龄转基因小鼠腓肠肌中FHL3基因极显著上调表达,I型肌纤维相关基因MyHC I/slow的表达极显著下调,II型肌纤维相关基因MyHC IIa、IIb、IIx显著上调表达。在蛋白水平,2月龄转基因小鼠腓肠肌中FHL3、MyHC、MyHC IIa和IIb蛋白极显著上调表达,MyHC I/slow和Myoglobin显著下调表达。同时对线粒体功能相关基因PGC1-α、COX2、COX4、AMPK和CS,糖酵解相关基因PDK4,介导蛋白质降解的泛素连接酶Atrogin-1,Murf1和Musa1以及肌肉生长发育相关基因Myf5、Myf6、MSTN、MEF2c的表达变化进行检测,PGC1-α、COX4、PDK4、Myf5、Myf6、MEF2c的表达显著上调,MSTN极显著下调表达。这些结果证明了转基因小鼠的肌纤维类型的转化,线粒体功能增强,能量转化和利用率提高。4.分离鉴定了转FHL3基因小鼠骨骼肌卫星细胞,通过实时定量PCR、Western Blot、流式细胞术和RTCAxCELLigence系统对肌卫星细胞的增殖能力进行了分析,结果表明过表达FHL3基因促进肌卫星细胞增殖,促进转基因小鼠的肌纤维数目和肌肉量增多。综上所述,本研究在活体水平上验证了FHL3基因具有促进肌纤维类型转化以及提高肌肉生长和重量的功能,为深入研究FHL3基因调控肌纤维类型转化的机制提供了新的思路。
【图文】：

模式图,胚胎干细胞,祖细胞,肌肉

华中农业大学 2018 届硕士研究生学位（毕业）论文但不同的基因调控网络决定着骨骼肌干细胞的诞生（Sambasivan et al.,2007）。对肌原性调节因子（MyoD）家族：MyoD，Myf5，肌细胞生成素 MyOG 和 MRF4 的鉴定，发现它们在肌肉前体细胞群的形成以及这些细胞在胚胎中的分化中起关键作用，通过基因敲除实验证明该家族的基因是肌卫星细胞形成的上游决定因子，而肌细胞生成素是大多数肌细胞分化所需的（Tajbakhsh and Buckingham,1999）。Pax7 基因在胚胎发育中期即开始调节胚胎干细胞和成肌祖细胞，同时 Pax3 和 Pax7 基因主要是在调节产前和围产期的肌肉中发挥重要作用（Harel et al.,2009）。大量的研究报道了肌卫星细胞参与肌肉的维持与再生，在肌肉损伤修复中意义重大（Yue et al.,2016），但肌卫星细胞的再生能力并非用之不尽，例如先天性的杜氏肌营养不良综合征患者，卫星细胞群体的不断消耗会导致病情恶化，最终死亡（Shi et al.,2007）。在成年个体中，促进静息的肌卫星细胞的活化，增殖，，能够分化为肌细胞，对肌萎缩等恶病质造成的消瘦有非常好的治疗效果（Kivel et al.,2016）。

示意图,家族,蛋白,功能研究

FHL3 基因调控肌肉生长和肌纤维类型转化的功能研究（Karlsson et al.,1990）。Kosa等研究发现，LIM家族的蛋6 23 H X2CX2CX2CX16 21CX2-3 (C/H/D)氨基酸保守序的研究显示具有高度保守序列的LIM结构域，是由两个指结构串联而成，具有稳定的三级蛋白质结构（Ostendo对功能研究的深入，发现LIM基序虽然含有共有序列/H]x2-4[C/H/E]x2Cx2Cx14-21[C/H]x1-3 [C/H/D/E])，但并通过介导蛋白质之间的相互作用来发挥功能（Kadrmas a综合前人的研究结果，LIM结构域是介导转录因子、信关蛋白质之间的相互作用的主要区域，是该基因家族发
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S813.1

【参考文献】