递送柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白与IL-18共表达核酸疫苗侵入型乳酸菌免疫保护效果研究

发布时间：2020-06-11 10:06

【摘要】：鸡球虫病(Coccidiosis)是由艾美耳属(Eimeria)一种或多种球虫所引发的原虫病,呈全世界性分布。该病危害性大、感染率高,是造成世界范围内家禽业严重经济损失的原因之一。目前该病的防治仍然以化学药物和活疫苗为主,但由此导致的药物残留、耐药性及新抗虫药开发困难等问题越来越严峻。活疫苗存在毒力返强、散毒等安全隐患,所以人们更加重视新型安全疫苗的研发。DNA疫苗具有安全、稳定、易制备的优点,并通常将细胞因子作为佐剂与DNA疫苗共同免疫机体,从而达到增强疫苗免疫效果的目的。乳酸菌作为益生菌具有定殖力强、易于培养、免疫调节等特点,可成为DNA疫苗的理想活载体,通过口服的方式将DNA疫苗递送到机体细胞内,从而引发局部或全身的免疫反应。为了提高乳酸菌对DNA疫苗的递送效率,本研究以新型的真核质粒pValac为表达载体,柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,E.tenella)的微线体蛋白2(EtMIC2)为保护性抗原,以鸡白介素18(ChIL18)作为佐剂构建出重组质粒,由表达金黄色葡萄球菌纤连蛋白A(FnBPA)的侵入型乳酸菌为载体递送到鸡体内,提高DNA疫苗的递送效率,并对机体产生的免疫水平及抗E.tenella保护效果进行评价。具体研究内容及结果如下:(1)表达EtMIC2蛋白和ChIL18的DNA疫苗构建及体外验证参考GenBank登录的EtMIC2及IL18序列,优化并常规合成基因EtMIC2-IL18,通过PCR扩增EtMIC2和EtMIC2-IL18基因片段,并分别连接至pValac载体上,双酶切和碱基序列测定结果表明重组质粒pValac-EtMIC2和pValac-EtMIC2-IL18构建成功。转染HEK-293T细胞,Western blot和间接免疫荧光检测EtMIC2和IL18蛋白在细胞质中表达。(2)携带DNA疫苗的侵入型乳酸菌的构建及体外侵入能力检测将pValac-EtMIC2和pValac-EtMIC2-IL18两种真核质粒,转化至NC8-pSIP409、NC8-pSIP409-FnBPA重组乳酸菌感受态中,构建出pValac-EtMIC2/pSIP409、pValac-EtMIC2/pSIP409-FnBPA、pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409、pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409-FnBPA四种菌株,经SPPIP诱导剂诱导表达后,通过Western blot检测FnBPA蛋白的表达情况,结果表明转入真核质粒后的侵入型乳酸菌的FnBPA蛋白成功表达。通过与分离的CEF细胞共培养2个小时,洗涤后,室温裂解10min,最后进行菌落计数并计算细胞侵袭率。结果显示pValac-EtMIC2/pSIP409-FnBPA菌株对CEF细胞的侵袭率达到0.25%,而pValac-EtMIC2/pSIP409作为对照菌株的侵袭率仅为0.09%。同样pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409-FnBPA菌株对CEF细胞的侵袭率为0.15%,pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409菌株的侵袭率为0.08%。表达FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌的细胞侵袭率显著高于非侵入型乳酸菌(P0.001)。(3)侵入型乳酸菌对雏鸡免疫水平的影响及抗E.tenella保护效果评价健康的1日龄肉雏鸡,随机分为6组,每组20只,分别为生理盐水组(GroupI)、攻虫组(GroupII)、pValac/pSIP409组(GroupIII)、pValac-EtMIC2/pSIP409组(GroupIV)、pValac-EtMIC2/pSIP409-FnBPA组(GroupV)、pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409-FnBPA组(GroupVI)。在1、3、5、12、14、16日龄进行口服免疫,每只免疫剂量为1×10~9CFU/200μL,并在30日龄进行攻虫(GroupI除外),攻虫剂量为5×10~4个/只。对每组雏鸡外周血CD3~+CD4~+及CD3~+CD8~+T淋巴细胞的发育情况、外周血中淋巴细胞增殖能力、肠道刮取物分泌型抗体SIgA、血清中特异性抗体及细胞因子含量进行检测。并对感染球虫一周后雏鸡的相对增重率、卵囊排出量、盲肠病变积分及抗球虫指数等指标进行统计。动物试验结果表明,在30d(攻虫前),与GroupI相比,GroupIV、GroupV、GroupVI雏鸡外周血中的CD3~+CD4~+T淋巴细胞含量显著较高(P0.05);在38d(攻虫后),GroupV、GroupVI雏鸡外周血中的CD3~+CD4~+T淋巴细胞含量均显著高于GroupIII(P0.01)。同样,在30d测得GroupVI雏鸡外周血中的CD3~+CD8~+T淋巴细胞含量约35%,显著高于GroupIII(P0.05);在38d测得GroupIV、GroupV、GroupVI均显著高于GroupIII(P0.001),其中GroupVI含量最高约为43%。对各组雏鸡外周血淋巴细胞增殖能力进行检测,结果表明,攻虫前后GroupVI增殖能力均最强,在30d时GroupVI刺激指数约为1.3,显著高于GroupIII(P0.001);在38d时,GroupVI刺激指数约为1.5,同样其增殖水平显著高于GroupIII(P0.001)。本研究在攻虫前对各组雏鸡血清中细胞因子IL-4、IFN-γ、IL-18的含量进行了检测,其中GroupVI雏鸡的IFN-γ含量较其他免疫组高,显著高于GroupIII(P0.01)。GroupVI中IL-18的含量显著高于各组(P0.001)。GroupVI肠道刮取物中SIgA的分泌量最高,且显著高于GroupV(P0.05)。攻虫后,GroupV、GroupVI平均体重增长水平较高,相对于GroupI相对增重率分别为79.66%、84.75%。GroupIV、GroupV、GroupVI粪便中卵囊排出量明显减少,其相对于GroupII卵囊减少率分别为67.73%、69.75%、76.16%。攻虫一周后观察发现GroupIV、GroupV、GroupVI雏鸡的盲肠病变明显减轻,平均计分分别为1.3、1.1、0.9。最后得出各组ACI值,GroupIV、GroupV、GroupVI分别为162.27、167.66、174.75,均能达到良好的抗球虫效果,GroupVI效果最佳。本研究基于表达FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌为载体,携带pValac-EtMIC2-IL18真核质粒递送到宿主体内,并能提高机体的体液免疫和细胞免疫,增强机体对球虫的抵抗能力。以侵入型乳酸菌为载体递送DNA疫苗的方式为球虫的防治提供了新思路和新方法。
【图文】：

PCR扩增,菌液

组乳酸菌与 CEF 细胞共培养MIC2/pSIP409、pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409、pValac-EtMIC2/pSI2-IL18/pSIP409-FnBPA 重组菌培养三个小时，然后 pVaA、pValac-EtMIC2-IL18/ pSIP409-FnBPA 这两种菌株各加 125μLL 菌液，并用 1mLPBS 悬起。细胞铺于 24 孔板中，每孔加对应的菌，剩余的菌液 105、106、107梯度滴板，将 24 孔细胞板 1000g 离CO2温箱中培养 2h，然后 PBS 洗 3 遍，每孔加含 F12 的 DMEM霉素）1mL，培养 2h，PBS 洗 3 次，然后加入 300μL、2%Trit比稀释滴板并计数。根据计数结果及相应公式最终得到细胞侵、EtMIC2-IL18 基因的扩增公司优化并常规合成基因 EtMIC2-IL18，制备出穿刺菌。经活设计合成引物，对 EtMIC2、EtMIC2-IL18 基因进行 PCR 扩增，糖凝胶电泳检测，结果如图 1.1、1.2 显示，在预期大小出现目M 1M 1

PCR扩增,菌液

组乳酸菌与 CEF 细胞共培养MIC2/pSIP409、pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409、pValac-EtMIC2/pSI2-IL18/pSIP409-FnBPA 重组菌培养三个小时，然后 pVaA、pValac-EtMIC2-IL18/ pSIP409-FnBPA 这两种菌株各加 125μLL 菌液，并用 1mLPBS 悬起。细胞铺于 24 孔板中，每孔加对应的菌，剩余的菌液 105、106、107梯度滴板，将 24 孔细胞板 1000g 离CO2温箱中培养 2h，然后 PBS 洗 3 遍，，每孔加含 F12 的 DMEM霉素）1mL，培养 2h，PBS 洗 3 次，然后加入 300μL、2%Trit比稀释滴板并计数。根据计数结果及相应公式最终得到细胞侵、EtMIC2-IL18 基因的扩增公司优化并常规合成基因 EtMIC2-IL18，制备出穿刺菌。经活设计合成引物，对 EtMIC2、EtMIC2-IL18 基因进行 PCR 扩增，糖凝胶电泳检测，结果如图 1.1、1.2 显示，在预期大小出现目M 1M 1
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.4

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