裂谷热病毒核酸和抗体检测研究

发布时间：2020-06-11 16:51

【摘要】：裂谷热(Rift Valley Fever,RVF)是由裂谷热病毒(Rift Valley Fever virus,RVFV)引起的急性、烈性人兽共患传染病。RVFV可经蚊虫叮咬、直接接触和气溶胶传播,主要感染绵羊、山羊和牛等反刍动物,可引起怀孕母畜的病死率高达80%~100%,成年反刍动物的病死率达20%,未出生的和幼龄动物病死率近100%,同时也能感染人引起发病。该病自1931年在肯尼亚大规模暴发后,多次在非洲东部、南部及阿拉伯半岛流行,给社会造成巨大的经济损失,严重危害公共卫生安全。因此,世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties,OIE)将RVF列为法定呈报传染病,我国农业部将其列为一类传染病。目前,国内外尚无获批的商品化人用RVF疫苗及有效治疗药物。当前,随着全球化经济贸易的快速发展,各国对动物制品贸易的进出口日益频繁,加之中国在地理位置上紧邻阿拉伯半岛,外来人兽共患病自然感染或输入性病例的风险也随之增加。2016年7月,我国北京确诊的首例输入性裂谷热病例为我们敲响了警钟。因此建立快速、敏感、特异的RVF诊断方法,进而实现对疫病的发生和流行的及早防控具有重要意义。RVFV为单股负链RNA病毒,属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)白蛉病毒属(Phlebovirus),仅有一个血清型。RVFV基因组由S、M、L 3个节段组成,其中S节段长1690 nt,采用双向编码策略,正义链编码一个非结构蛋白(Non-structural protein,NSs),反义链编码核衣壳蛋白(Nucleoprotein,NP);M节段长3885 nt,编码四个蛋白,两个囊膜糖蛋白Gn和Gc,两个非结构蛋白NSm1和NSm2;L节段长6404 nt,编码RNA依赖的RNA聚合酶。本研究旨在建立RVFV核酸和抗体快速检测方法,为RVF的快速诊断、监测预警与流行病学调查等提供简单、快速、敏感的检测技术和方法。1.RVFV反转录环介导等温扩增核酸可视化检测方法的建立与评价本研究针对不同分离年代、不同种属、不同地域来源的共25条RVFV S基因进行序列分析,通过MEGA 7软件分析筛选序列的高度保守区,针对保守区设计6条特异性引物,用于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。通过优化扩增时间、温度、引物浓度来提高扩增效率,建立RVFV反转录环介导等温扩增核酸可视化(Reverse Transcription Loop-mediated isothermal amplification nucleic acid visualization,RT-LAMP-VF)检测方法,并进行特异性评价、敏感性评价、与Real-time RT-PCR方法的对比评价以及模拟临床样本初步评价。结果显示:以人工合成的RNA为模板,成功建立了RVFV RT-LAMP-VF检测方法,在63℃反应20 min即可检测到1.94×10~5 copies/μL的病毒RNA,反应60 min,检测限可达1.94×10~0 copies/μL的RNA。以RVFV-BJ01株灭活病毒提取的RNA为模板,可检测到1.83×10~3 copies/μL的病毒RNA。此外,该方法对模拟临床样本检测的结果为阳性。综上,RVFV RT-LAMP-VF方法通过使用一次性核酸可视化检测装置观察扩增结果,实现了肉眼可见、结果更直观的读取同时避免了常规等温扩增中的气溶胶污染问题,结果精准、敏感性强、特异性高、无需昂贵仪器设备,适用于现场检测。2.RVFV间接血凝抗体检测方法的建立与评价本研究通过PCR扩增RVFV Gn蛋白胞外区(ectodomain,eGn)基因,连入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-RVFV-eGn,将重组质粒转化至BL21/DE3感受态,IPTG诱导蛋白表达,经脲素复性后再经His标签蛋白纯化柱纯化目的蛋白。将纯化的目的蛋白作为抗原,致敏醛化后的绵羊红细胞。通过优化致敏时间、抗原量、反应温度建立RVFV间接血凝抗体检测方法,进行重复性、RVFV血清样品检测,特异性评价。结果显示:PCR特异性扩增出1287 bp的目的片段,并成功构建出重组质粒DE3-pET30a(+)-RVFV-eGn。将重组质粒转化BL21感受态细胞后可有效表达目的蛋白,确定最佳表达条件为30℃,0.8mmol/L IPTG诱导5 h,目的蛋白以包涵体形式表达。纯化后目的蛋白纯度为94.136%,以其作为抗原,确定最佳致敏条件为37℃,200μg/mL的抗原量致敏3 h。综上,本研究成功建立了RVFV间接血凝抗体检测方法,该方法安全性高、操作简单、可用于批量样本检测,为RVF新型疫苗的评价和疫病监测提供了一种简便、快捷的检测手段。
【图文】：

示意图,基因结构,示意图,反刍动物

图 1-1 RVFV 基因结构示意图[9]Figure 1-1 Schematic of genome structure of RVFV[9]的流行状况源性人兽共患传染病。未出生的和幼龄反刍动物感染后，病病死率达 20%，人感染后病死率约为 1%，有 5%的感染者会出炎。人可通过携带病毒的伊蚊、库蚊等叮咬、接触患病动物肉、奶等感染；成年反刍动物（牛、羊等）可通过蚊虫叮咬

示意图,原理,示意图,间接血凝试验

图 1-3 LAMP 原理示意图[47]Figure 1-3 Schematic of the principle of LAMP[47]凝试验验（Indirect Heamagglutination assay，IHA）的原理是将制后加入检测样品，通过抗原抗体特异性反应，使红细胞聚集Feng 等人早在 1978 年利用间接血凝试验诊断棘球蚴病，检性[53]。1985 年，，Yang 等人将日本血吸虫卵冷浸抗原液致敏，诊断血球于 4℃冰箱可保存 2 年以上，检测结果与。1990 年，Luo 等人建立了间接血凝试验用于检测鸭瘟病毒1993 年，Li 等人建立了用于检测猪瘟病毒抗体的间接血凝，且与其他病原体无交叉反应[56]。1996 年，Sun 等人建立接血凝试验，与中和试验相比阳性符合率为 84.6%[57]。199菌致敏醛化后的绵羊红细胞，建立间接血凝试验检测猪传染价达 1:512~1:1024[58]。2001 年，Cai 等人以猪繁殖与呼吸综样本，与 ELISA 方法的符合率达 98%[59]。2003 年，Li 等分猪瘟抗体，结果表明两者符合率为 84.8%，具有较高的相关
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65

【参考文献】