gga-miR-206在金茅黑鸡胚胎骨骼肌发育中的表达分析及靶基因验证

发布时间：2020-06-11 21:10

【摘要】：miRNAs是近来发现重要的表观遗传因子,其在转录后水平对基因表达起重要调控作用,并广泛参与机体的各个生命过程。胚胎期的肌肉发育决定了肌纤维的总数,对畜禽肌肉产量、生长速度及成年体重等具有至关重要的影响。为探究miRNA对胚胎期骨骼肌发育的调控作用及其分子机制,并为肌肉发育调控寻找新的靶点,以课题组前期通过高通量测序技术筛选到的鸡成肌细胞由增殖到分化各不同时期差异表达的关键miRNAs及预测的与其表达成负相关的靶基因(P0.01)信息为基础,本试验以其中显著上调关键miRNA gga-miR-206(P0.01)作为研究的切入点,并结合其他数据库共同预测结果选取其中显著下调的远端上游元件结合蛋白1(FUBP1)、胸腺素β4(TMSB4X)及酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白β(YWHAB)(P0.01)作为候选靶基因。分别通过实时荧光定量、双荧光素酶报告检测系统以三次独立并至少两次重复试验,对miRNA及各候选靶基因的表达量以及靶关系进行了探究和鉴定。主要结果如下:1、gga-miR-206及候选靶基因发育表达谱及相关关系分析。运用实时荧光定量PCR的方法,分析了 gga-miR-206与候选靶基因在胚胎发育各不同时期骨骼肌中的相对表达量并通过软件对其之间相关性进行分析。结果表明,gga-miR-206在腿肌中的表达整体呈先上升后下降的趋势,且在16胚龄(E16)达到高峰(P0.05),在胚胎发育后期至出生后又有所回升;而在胸肌中表达整体呈现下降趋势,10胚龄(E10)时表达量最高(P0.05),在16胚龄(E16)出现一个小高峰。相关性分析结果显示,在鸡胚骨骼肌发育过程中,YWHAB的表达与gga-miR-206呈负相关(P0.05);其次,TMSB4X与gga-miR-206的表达呈负相关(P0.05);与之相反,FUBP1的表达与gga-miR-206之间呈正相关(P0.05)。2、候选靶基因组织表达谱构建。运用qRT-PCR技术分别检测了三个候选靶基因在300日龄金茅黑鸡A系母本8个组织中的相对表达情况,对各基因功能进行初步定位判断,结果显示:FUBP1富集于肝脏和腿肌组织,极显著高于其余组织中的表达量(P0.01);相对于此,FUBP1在心肌中则表达较少,而在胸肌和卵巢组织中则几乎不表达;对于YWHAB则高表达于骨骼肌组织(P0.01),在心肌中也有少量表达,而在脾和卵巢组织中表达最低;TMSB4X在各组织中均有不同程度表达,在心肌和胸肌中相对高表达,其次为腿肌、肝、脾、肺等组织,而在肾和卵巢组织中表达量最少,与其余组织间差异显著或极显著(P0.05 orP0.01)。3、gga-miR-206与YWHAB/FUBP1靶关系验证。结合前述研究内容,对gga-miR-206与YWHAB/FUBP1之间的靶关系进行了鉴定。分别构建YWHAB/FUBP13'UTR野生型和突变型pmirGLO表达载体,并与miR-206模拟物、阴性对照分别共转染人胚肾293T细胞,以转染空载组作为空白对照。双荧光素酶报告基因检测结果显示,与对照组相比,共转染YWHAB野生型载体与miR-206 mimics组显著降低萤火虫荧光素酶的相对活性(P0.05),但其余各组试验组与对照组之间均无显著差异(P0.05)。结果提示YWHAB与gga-miR-206存在靶关系,该基因mRNA3'UTR 1429-1435核苷酸序列为关键作用靶点;FUBP1则不是gga-miR-206的靶基因。
【图文】：

Ｍｌ邋２邋３逦４邋５邋６邋７逦８邋９邋１０邋１１邋１２逡逑■Ｈ逡逑９９９ｃ／９９９邋ｃｆｄ－９ｃｆ９逡逑图２．１鸡胚的性别鉴定结果逡逑６．邋２组织ＲＮＡ完整性检测结果逡逑对提取的鸡各胚龄骨骼肌组织总ＲＮＡ进行检测，１％琼脂糖凝胶电泳结果（图２．２）显逡逑示总ＲＮＡ的２８Ｓ和１８Ｓ条带清晰，５Ｓ几乎没有，２８Ｓ条带与１８Ｓ条带的比值＞１．５；逡逑ＯＤ２６０／ＯＤ２８０介于１．８？２＿０之间。表明ＲＮＡ完整性好，无ＤＮＡ、蛋白质和其它杂质污染，逡逑可用于后续实验。逡逑＾２８Ｓ逡逑－ｌＯＯ逡逑ｍｎｎ＾ｉ－ｓｓ逡逑图２．邋２邋ＲＮＡ完整性检测逡逑（Ｍ：邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１、２、３、４邋为各样品号）逡逑６．邋３邋ｍｉ邋ＲＮＡ定量分析逡逑ＡＢＩ邋７５００荧光定量ＰＣＲ结果显示（图２．３－图２．４），扩增曲线重叠性好，熔解曲线显逡逑示为平滑的单峰，在Ｔｍ两边均无杂峰。表明所设计引物特异性良好，，无引物二聚体和非逡逑特异性扩增。逡逑

图２．１鸡胚的性别鉴定结果逡逑６．邋２组织ＲＮＡ完整性检测结果逡逑对提取的鸡各胚龄骨骼肌组织总ＲＮＡ进行检测，１％琼脂糖凝胶电泳结果（图２．２）显逡逑示总ＲＮＡ的２８Ｓ和１８Ｓ条带清晰，５Ｓ几乎没有，２８Ｓ条带与１８Ｓ条带的比值＞１．５；逡逑ＯＤ２６０／ＯＤ２８０介于１．８？２＿０之间。表明ＲＮＡ完整性好，无ＤＮＡ、蛋白质和其它杂质污染，逡逑可用于后续实验。逡逑＾２８Ｓ逡逑－ｌＯＯ逡逑ｍｎｎ＾ｉ－ｓｓ逡逑图２．邋２邋ＲＮＡ完整性检测逡逑（Ｍ：邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１、２、３、４邋为各样品号）逡逑６．邋３邋ｍｉ邋ＲＮＡ定量分析逡逑ＡＢＩ邋７５００荧光定量ＰＣＲ结果显示（图２．３－图２．４），扩增曲线重叠性好，熔解曲线显逡逑示为平滑的单峰，在Ｔｍ两边均无杂峰。表明所设计引物特异性良好，无引物二聚体和非逡逑特异性扩增。逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S831

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本文编号：2708461