gga-miR-16调控鸡毒支原体感染的作用机制研究

发布时间：2020-06-12 12:08

【摘要】：鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)感染主要引起鸡慢性呼吸道疾病(CRD)。鸡慢性呼吸道疾病是以呼吸Up音、咳嗽及流鼻涕等为主要临床特征的高度接触性传染病,给家禽养殖行业带来巨大的经济损失。鸡毒支原体感染的发病机制至今尚未阐明,探究其发病机制尤为重要。研究证实micro RNAs在许多疾病的发生发展中起重要作用。本研究在前期高通量测序的基础上,以gga-mi R-16-5p为研究对象,探究其在MG感染中的作用及调控机制。试验通过Real-time Quantitative PCR(q PCR)检测了鸡胚及DF-1细胞中gga-mi R-16-5p的相对表达量,以确证高通量测序结果的准确度。结果发现gga-mi R-16-5p在鸡胚感染MG-HS后第6d、7d、8d肺组织及感染MG-HS的DF-1细胞中的表达量显著或极显著高于正常组(p0.05或p0.01)。使用靶基因预测软件Target Scan和mi RDB预测gga-mi R-16-5p的靶基因,选取软件预测交集并结合炎症通路进行筛选,初步确定PIK3R1作为gga-mi R-16-5p的候选靶基因。双荧光素酶报告基因检测发现,gga-mi R-16-5p能够与PIK3R1 3’UTR的种子序列结合,能显著抑制PIK3R1 3’UTR区域的报告基因活性。进一步通过q PCR及Western blot分析发现,在转染DF-1细胞后,gga-mi R-16-5p超表达能显著抑制PIK3R1 m RNA及蛋白的表达,同时显著抑制PI3K/AKT通路下游蛋白P-AKT的表达量,然而抑制gga-mi R-16-5p后的结果与超表达正好相反。通过q PCR检测靶基因PIK3R1在DF-1细胞及鸡胚肺组织中的相对表达量,结果表明,鸡胚感染MG-HS后第7d、8d肺组织及MG-HS感染的DF-1细胞中PIK3R1的表达量显著或极显著低于正常组(p0.05或p0.01)。通过CCK-8及流式细胞仪分别检测了gga-mi R-16-5p对DF-1细胞增殖及细胞周期的影响,发现MG能显著抑制DF-1细胞的增殖,使大量的细胞停滞在细胞周期的G1期;DF-1细胞中过表达gga-mi R-16-5p后,在48h和72h,过表达gga-mi R-16-5p能显著降低DF-1细胞的增殖速率(p0.01),由G1期进入G2期的细胞大量减少;而抑制gga-mi R-16-5p后72h,DF-1细胞增殖显著增加(p0.01),大量的细胞进入细胞周期的G2+S期。过表达gga-mi R-16-5p能使细胞大量凋亡,抑制gga-mi R-16-5p后细胞凋亡减少。过表达gga-mi R-16-5p后,NF-κB以及下游的TNF-α表达量显著下降(p0.05)。本研究确证了鸡胚及细胞感染MG-HS后,gga-mi R-16-5p的表达量显著上调,通过降低靶基因PIK3R1的表达而抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路的活性,通过抑制细胞周期进程,促进细胞凋亡而阻滞细胞的增殖,使大量细胞停留在G1期。
【图文】：

图 3-1 PCR 扩增检测内参基因 5S-rRNAarker I，1-10 泳道为肺组织样的 cDNA，11 泳道为阴Fig.3-1 Detect the quality of cDNA using 5Sarker I, Lane1-10: cDNA of lung tissue; Lane11: negative6-5p 的扩增及检测糖凝胶电泳检测肺组织 cDNA，各样本在 80 b相符，，初步推测已获得 gga-miR-16-5p 基因（8图 3-2 PCR 扩增检测肺组织中 gga-miR-16-5p

图 3-1 PCR 扩增检测内参基因 5S-rRNArker I，1-10 泳道为肺组织样的 cDNA，11 泳道为阴Fig.3-1 Detect the quality of cDNA using 5Sker I, Lane1-10: cDNA of lung tissue; Lane11: negativ-5p 的扩增及检测糖凝胶电泳检测肺组织 cDNA，各样本在 80符，初步推测已获得 gga-miR-16-5p 基因（
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.31

【参考文献】

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本文编号：2709510