仔猪A型产气荚膜梭菌β2毒素毒性作用及菌株JXJA17全基因组序列分析

发布时间：2020-06-12 15:01

【摘要】：产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringens,Cp)广泛存在于土壤、饲料、食物及人畜肠道,但在一定条件下,可引起人和多种动物疾病。该菌致病作用主要源于其产生的毒素,Cp产生的毒素多达16种以上,依据其产生的α、β、ε、ι四种毒素将该菌分为A、B、C、D、E 5个型。A型Cp(Clostridium Perfringens type A,CpA)曾被认为是仔猪肠道微生物区系的一种正常厌氧菌,在仔猪坏死性肠炎(necrotizing enterocolitis,NEC)致病过程中的影响直到近年来才引起研究者的注意。仔猪NEC对现代化养猪业的影响在江西省乃至全国范围内都越来越大,且随着抗生素在饲料中的限制使用,该病对养殖业的影响将更为严重。而引起仔猪NEC的因素涉及到微生物感染、营养及环境因素,非常复杂。本试验通过多重PCR方法从仔猪腹泻粪样中分离携带β2毒素的A型产气荚膜梭菌,针对分离株毒性作用建立小鼠试验模型;提取质粒,对质粒进行毒素检测后,筛选JXJA17菌株进行高通量测序分析;通过酵母双杂交试验对β2毒素的毒性作用进行研究。1.携带β2毒素的A型产气荚膜梭菌的分离筛选及动物试验试验采用改良TSC培养基从江西省6个地区腹泻哺乳仔猪新鲜粪便中初分离Cp,再对所分离Cp菌株进行生化和16SrDNA分子鉴定,通过多重PCR技术对Cp进行基因分型,并对CpA菌株β_2毒素基因携带率进行统计,同时检测菌株CPE毒素,然后挑选其中15株菌提取质粒,检测质粒携带β2及CPE毒素情况。最后将CpA(β_2+/β_2-)分离株进行小鼠毒性试验。结果显示,65份哺乳仔猪粪便样品中,Cp分离率100%,CpA分离率100%,分离得到65株CpA,其中CpA菌株的β_2毒素携带率为98%,仅分离到一株CpA(β2-)的菌株。所分离的CpA菌株通常携带2~3个或3个以上质粒,且β_2毒素基因位于CpA质粒中,未能在质粒中检测到CPE毒素基因;来源于腹泻CpA(β_2+)、CpA(β_2-)和健康样品的CpA(β_2+)菌株(来源于实验室分离保存)培养上清腹腔接种小鼠,均可引起小鼠不同程度死亡。兔回肠结扎试验表明腹泻来源的CpA(β2+/β2-)毒性作用均强于健康来源的CpA(β2+)。江西地区仔猪肠道CpA携带率及CpA(β_2+)比例均高;β2毒素毒性试验结果提示其毒性作用与菌株来源健康或腹泻仔猪、是否携带β_2毒素关系不大,与β2毒素基因表达有关,也可能与宿主肠道环境相关。2.JXJA17 CpA(β2+)江西分离株基因组从头测序分析将试验一中通过分离鉴定、质粒提取、毒素鉴定及小鼠毒性试验等筛选的代表菌株JXJA 17通过高通量微生物基因组从头测序分析,结果显示JXJA 17基因组全长3,324,072bp,包含9个完整质粒,共编码3396个基因。其中基因组编码3092个DNA序列,30个rRNA基因(10 5S,10 16S和10 23S),95个tRNA基因和0个非编码RNA。9个质粒大小分别为:58,796、38,284、62,027、40,125、36,275、12,326、12,133、3,550和11,801bp。毒素数据库对比显示仅含有α毒素与β2毒素,耐药基因高达20余种,通过基因组圈图绘制、eggNOG功能注释、KEGG功能注释、CRISPR等预测对JXJA17致病株进行分析,有助于了解该细菌在本地区流行病学变迁及进化特点。本试验对JXJA17致病株进行全基因测序,了解本地区CpA基因组特点,特别是本地区携带率较高的β2毒素基因的特点,为研究CpAβ2毒素的毒性作用提供前期研究基础,也为研究我国仔猪梭菌性肠炎分子流行病学特点提供基因参考。3.β2毒素酵母双杂交试验为进一步研究β2毒素毒性作用,采用猪肠上皮细胞建立文库,研究β2毒素与猪肠上皮细胞蛋白之间的相互作用,根据JXJA17测序结果扩增β2毒素基因,进行酵母双杂交试验。试验结果表明β2毒素转入酵母体内,对酵母生长不产生抑制作用,pGBKT7-β2毒素融合蛋白成功在酵母体内表达,猪小肠细胞系IPEC-1存在与β2毒素相互作用的蛋白,而相互作用蛋白的作用机制还需要更进一步的深入研究。本试验采用的β2毒素酵母双杂交试验为进一步研究β2毒素毒性作用提供试验参考。
【图文】：

毒素,质粒,细胞毒性,致死性

4图1CpA 质粒毒素携带情况Fig 1 Description of CpA plasmid toxin4.3 β2 毒素生物学特性编码 β 和 β2 毒素的基因已被报道位于 Cp 菌的非连接大质粒上，β2 毒素与 β 毒素具有相似的生物学活性，均是具有细胞毒性与致死性的强毒素。Gilbert[9]等报道静脉注射 3μg 纯化的 β2 毒素对小鼠具有致死性。β2 毒素在体外具有活性，对小肠黏膜上皮细胞（I407，现被美国典型培养物收藏列为 HeLa 细胞）与中国仓鼠卵巢细胞具有强细胞毒性,导致细胞变圆和死亡[9]。然而，细胞毒性剂量并非绝对的，而是介于0.2～20ug/ml 浓度范围内，并且毒素不稳定时更易丧失毒性。目前还不知道β2 毒素是如何引起细胞死亡的，但已提出可能与β毒素作用机制相似，在细胞膜上形成孔隙或导致细胞膜破坏

荚膜染色,产气荚膜梭菌,牛乳,发酵试验

注射同等剂量生理盐水，观察 48h 小鼠死亡情况；（4）重复（3）试验，，每组小鼠增加至 10 只。1.6 携带β2 毒素 CpA 兔回肠结扎试验选取试验菌株 5 株：CpA（CVCC2020，β2-）、CpC（CVCC2041）、CpA（腹泻分离株β2-）、JXJA17（腹泻样分离株β2+）、3B（健康样分离株β2+）、空白组（肉肝胃酶培养基），将选取菌株接至 FTG 液体培养基内 37℃扩增 18h 后，接至肉肝胃酶消化培养汤中培养 8h，收集菌液注射准备。兔子保定后，实施麻醉，剖开腹腔，找到回肠结扎，注射菌样 1ml，兔子体内保存 6h 后，观察病变。2 结果2.1 细菌分离、生化鉴定及 16SrDNA 鉴定结果所分离得到的菌株在 0.04%D-环丝氨酸 FTG 培养基中生长，培养基变浑浊，并有气泡产生。接种于血平板培养后，形成圆形、边缘整齐、灰白色、表明光滑半透明、圆屋顶状的菌落；菌落周围有双层溶血圈，细菌纯化后经革兰氏染色镜检，可见两端钝圆的革兰阳性直杆状菌，多为单个散在或成对排列，无鞭毛。如图 2-1 所示。
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61

【参考文献】