转录组测序分析SPF鸡胸腺中与自然重组ALV互作的固有免疫因素

发布时间：2020-06-13 06:48

【摘要】：禽白血病(Avian leukosis,AL)是一种由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)引起的鸡的以垂直传播为主的肿瘤性传染病,目前在世界上广泛分布。随着科学家不断的研究和探索,目前已经发现A、B、C、D和J亚群5种外源性的白血病病毒,以及E、F、G、H和I亚群5种内源性病毒。在鸡群中可分离到的ALV分别属于A、B、C、D、E和J6个亚群,近年研究者认为我国鸡群中存在K亚群ALV。总结以往的研究发现,A亚群、B亚群和J亚群是现场流行最广的ALV亚群。本实验室于2017年从疑似患有AL的河田鸡中分离并鉴定了自然重组毒株ALV-FJ15HT0,该毒株具有ALV-B特异性gp85基因序列、ALV-Egp37序列和ALV-JLTR序列。为研究该毒株的分子特性及致病特性,本研究通过建立人工感染动物模型,模拟垂直传播,并且通过转录组测序分析,进一步探究参与重组ALV与宿主细胞之间互作的基因,并且从蛋白质水平上加以分析验证,为进一步研究自然重组ALV的致病机制等提供科学数据。1.感染组鸡体重及免疫器官指数的变化在2d、5d、9d、13d、17d、21d时称量空白对照组和垂直感染组鸡体重,采集血液、肝脏、脾脏、法氏囊和胸腺,并且称量器官重量,计算免疫器官指数,使用qRT-PCR在不同时间点测量gp85在不同组织中的表达。结果显示,感染组鸡胚在孵化后生长受到显著性抑制(P0.01),感染组法氏囊器官指数显著受抑(P0.05),而感染组和对照组的脾脏,胸腺和肝脏器官指数在检测的这6个时间点上没有显著差异(P0.05)。随着日龄的增长,ALV病毒含量随着日龄的增长而显著增加;相关性分析显示,包括法氏囊(r=-0.546),脾脏(r=-0.502)和肝脏(r=-0.517)在内的感染组织中gp85基因表达的变化与相应的体重差异之间呈现出显著相关性(P0.05),感染组胸腺组织中gp85转录水平变化与相应的体重差异之间呈现出极显著相关性(r=-0.559,P0.01)。2.自然重组ALV感染SPF鸡胸腺转录组学分析本研究将ALV-FJ15HT0接种到6胚龄(ED)SPF鸡胚的卵黄囊中模拟垂直传播,同时设立空白对照组。分别于5日龄(d)、13d和21d时无菌采集空白对照组和感染组鸡胸腺进行转录组测序。结果显示,5d时在两组动物胸腺样品中检测到227个差异表达基因(DEG)、13d检测到286个DEG,21d检测到251个DEG,这些DEG主要涉及细胞过程、结合、生物学调节、代谢加工、刺激反应和免疫系统等反应。通过信号通路富集分析发现,这些DEG主要涉及的信号通路有烟酸和烟酰胺代谢、细胞因子-细胞因子受体相互作用、脂肪酸降解、PPAR信号通路、细胞外基质受体相互作用、细胞粘附分子、JAK-STAT信号通路等。运用qRT-PCR技术对转录组测序得到的部分差异表达的基因进行验证,结果显示两者的检测结果相一致。3.睫状神经营养因子(CNTF)及其受体(CNTFRα)参与病毒宿主互作通过信号通路分析,发现一个有趣的基因即CNTFRα在感染SPF白莱杭鸡胸腺中表达显著上调,经过对该基因的动态表达进行qRT-PCR检测。结果显示,在感染鸡胸腺中CNTFRα基因表达在13-21d期间极显著上调(P0.01),对感染鸡和对照鸡群血清CNTF滴度进行ELISA检测发现感染鸡血清CNTF在17-21d显著上升(P0.05)。通过Pearson相关性分析发现:感染鸡胸腺中CNTFRα基因表达水平与相应的gp85基因表达水平呈现极显著正相关关系(r=0.656,P0.01),进一步验证发现,感染鸡肝脏中CNTFRα基因表达水平与相应的gp85基因表达水平呈现显著正相关关系(r=0.525,P0.05),可知CNTF及CNTFRα可能参与重组ALV与宿主之间的互作。通过原核表达技术获得鸡CNTFRα蛋白并进行纯化,浓度达到0.6 mg/mL。将纯化后的蛋白在新西兰白兔皮下进行5次多点注射免疫,使其产生抗体。使用Western Blot技术对兔血清抗鸡CNTFRα抗体进行特异性检测,结果显示,抗体浓度在1:2 000时,抗体结合率最高且特异性强。以Western Blot鉴定空白对照组和垂直感染组动物胸腺CNTFRα蛋白。结果显示,空白对照组和垂直感染组鸡胸腺中CNTFRα蛋白表达水平均随着日龄增加而降低,在13-21d时,垂直感染组鸡胸腺中CNTFRα蛋白表达水平显著高于空白对照组(P0.05),这一结果与CNTFRα转录水平结果相一致。进一步证实CNTFRα参与病毒与机体的互作。
【图文】：

合［１５］，启动ＡＬＶ的反转录过程。禽白血病病毒的非编码区分布在两端，形成长末逡逑端序列（Ｌｏｎｇ邋ｔｅｒｍｉｎａｌ邋ｒｅｐｅａｔｓ，邋ＬＴＲ）影响病毒ＲＮＡ的复制及翻译；编码区则由逡逑核心蛋白、酶蛋白、ＤＮＡ聚合酶和囊膜蛋白４个结构基因组成，见图１－２［１６］。核心逡逑蛋白包含衣壳蛋白ｐ２７是群特异性抗原，是ＡＬＶ亚群分类的主要依据之一。病毒逡逑囊膜糖蛋白包括ｇｐ８５和ｇｐ３７两种，外膜蛋白ｇｐ８５具有特异性识别功能，能够识别逡逑靶细胞的特异性病毒受体，也具有亚群特异性，也是ＡＬＶ亚群分类的主要依据之逡逑一，ｇｐ３７为穿膜蛋白（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ，邋ＴＭ），，负责病毒转入细胞［１７］。病逡逑毒经反复冻融后会发生病毒粒子裂解同时释放Ｐ２７群特异性抗原［１８］。逡逑５．１．？叫逦｜３观逡逑Ｉ逦Ｉ！逦Ｈ—邋ｅ？ｖ邋—逡逑－ｓ－ｉｒｒＲ－４逦ｓ邋叩逦逦ｐ0ｉ逦Ｈ逦ｋｕＴＲ－ｊ逡逑ｌ｜ｌ邋Ｉ邋１｜邋Ｉ邋Ｉ邋ＩＩ＂１丨痛逡逑Ｕ３邋Ｒ邋Ｕ５邋Ｐｌ邋９ｐ２Ｐｌ邋0邋ＰＺ１邋ｐｌ邋２邋Ｐ１５邋ＲＴ邋ＩＮ邋８Ｐ８５逦ＤＲ１邋Ｕ３ＲＵＳ逡逑图１－２邋ＡＬＶ的基因组结构图［１６］逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｇｅｎｏｍｅ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＡＬＶ逡逑１．３邋ＡＬＶ的分类逡逑随着科学家不断的研宄和探索，至今已经发现Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ和Ｊ亚群５种逡逑外源性禽白血病病毒，以及Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ和Ｉ亚群５种内源性禽白血病病毒。目逡逑２逡逑

（ｒ＝－０．５４６），脾脏（ｒ＝－０．５０２）和肝脏（ｒ＝－０．５１７）在内的感染组织中ｇｐ８５表达逡逑的变化与相应的体重差异显著相关（户＜0．0５）。胸腺中ｇｐ８５基因的动态表达如逡逑图２－２ａ所示，感染组胸腺中ｇｐ８５的倍数变化与体重差异极显著相关（ｒ＝－０．５５９，逡逑尸＜０．０１）（图２－２ｂ）。据此，选择胸腺作为用于转录组学检测的组织。逡逑２４邋逦邋２０邋逦逦逦逡逑＜３）２0邋．逦□邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ｇｒｏｕｐ邋１邋Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋Ｇｒｏｕｐ邋ｊ逦＾邋１０逦0逡逑．２邋１５逦Ｔ邋ｉ邋‘W 逦Ｓ逦￣＾￣３＾０￣４００５００￣６００￣逡逑ｉ：：邋ｉ邋ｉ逡逑〗４」Ｊ」．［Ｌ丨：：９逦＾、逡逑＾邋Ｉ邋ｒｎ曑ｉ门＿邋ｉ门■邋ｉ门圈ｉ门Wｉ邋ｎ＿逦ｒ逡逑、逦２ｄ邋５ｄ邋９ｄ邋１３ｄ邋１７ｄ邋２１ｄ邋ｅ邋
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4

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本文编号：2710815