小尾寒羊公羊繁殖性能研究及其睾丸发育miRNA-mRNA表达谱联合分析

发布时间：2020-06-14 01:21

【摘要】：公羊繁殖性能主要体现在配种能力和精液品质两个方面,精液品质则与睾丸组织结构密切相关。睾丸发育和精子发生是影响公羊繁殖能力的重要因素。小尾寒羊是我国优良的地方绵羊品种,以高繁殖力著名,是肉羊产业发展中广泛使用的母本品种,在我国肉羊产业化发展过程中发挥着重要作用。本研究以小尾寒羊公羊为研究对象:一、对小尾寒羊公羊进行繁殖性能研究挑选出2月龄,6月龄和12月龄小尾寒羊睾丸,采用H.E.染色方法进行组织学观察。二、在2月龄,6月龄和12月龄小尾寒羊睾丸组织结构和精子发生进程差异的基础上,构建睾丸mRNA文库和sRNA文库,利用RNA-seq测序技术和生物信息学方法对2月龄,6月龄和12月龄小尾寒羊睾丸中mRNA和miRNA的表达谱进行分析,并对miRNA与mRNA表达谱进行联合分析,构建miRNA-靶基因调控网络,筛选出睾丸发育和精子发生的关键miRNA及其靶基因。三、利用qRT-PCR方法对测序数据进行验证,并采用双荧光素酶报告基因检测系统对筛选出的睾丸发育和精子发生关键miRNA及其靶基因的靶向调控作用进行验证。旨在为揭示小尾寒羊公羊睾丸发育和精子发生的分子调控机制及影响其优秀繁殖性能的分子标记提供理论依据。本研究获得的主要研究结果如下:1.小尾寒羊公羊繁殖性能研究:结果表明,小尾寒羊公羊具有性早熟特性,公羔在75-88日龄出现性行为,6月龄可达性成熟。小尾寒羊睾丸发育与睾酮分泌水平呈正相关,成年公羊射精量多,精液密度大,精子活率高,精子在体外存活时间长,精液品质好,可用于常年配种。且2月龄,6月龄和12月龄小尾寒羊睾丸在曲细精管直径和生精细胞数量等组织学上存在明显差异,可用于后续转录组差异分析。2.不同月龄小尾寒羊睾丸mRNA表达谱分析:成功构建了2月龄,6月龄和12月龄小尾寒羊睾丸mRNA文库,2月龄vs 6月龄睾丸获得630个差异基因(470个上调和160个下调),6月龄vs 12月龄睾丸获得322个差异基因(218个上调和104个下调),2月龄vs 12月龄睾丸获得102个差异基因(82个上调和20个下调)。GO和pathway分析表明2月龄vs 6月龄睾丸的差异基因显著富集到雄性求偶,类固醇代谢和精子发生等191个生物过程及氨基糖与核苷酸代谢,核苷酸切除修复及AMPK等17条信号通路。6月龄vs 12月龄睾丸的差异基因显著富集到有性生殖,发育性细胞凋亡及精子获能等311个生物过程及核糖体,多糖降解和核黄素代谢等8条信号通路。3组差异基因取并集后获得的955个差异基因趋势分析,共获得8种表达谱并归类为4种模式表达谱,根据4种模式表达谱构建了4个基因间共表达网络,筛选出29个睾丸发育和精子发生的关键基因。随机选取13个基因(CA3,APOH,MYOC,CATSPER4,SYT6,SERPINA10,DAZL,ADIPOR2,RAB13,CEP41,SPAG4,ODF1和FRG1)对mRNA测序数据进行qRT-PCR验证,qRT-PCR结果与RNA-seq结果趋于一致,证明了mRNA测序数据的准确性。3.不同月龄小尾寒羊睾丸miRNA表达谱分析:成功构建了2月龄,6月龄和12月龄小尾寒羊睾丸miRNA文库,2月龄vs 6月龄,6月龄vs 12月龄和2月龄vs12月龄睾丸中分别鉴定出差异表达绵羊已知miRNA:5个,1个和4个;差异表达novel miRNA:132个,105个和24个。选取6个差异表达绵羊已知miRNA(oar-miR-379-5p,oar-miR-665-3p,oar-miR-200b,oar-miR-409-3p,oar-miR-495-3p和oar-miR-200c)和6个差异表达novel miRNA(has-miR-3592-5p,has-miR-6820-3p,has-miR-3615,mmu-miR-1957b,mmu-miR-182-3p和mmu-miR-1929-3p)对miRNA测序数据进行qRT-PCR验证,qRT-PCR结果与RNA-seq测序结果趋于一致,证明了miRNA测序数据的准确性。4.差异表达miRNA靶基因预测:结合miRNA与mRNA结果,对2月龄vs 6月龄,6月龄vs 12月龄和2月龄vs 12月龄睾丸差异表达miRNA进行靶基因预测,差异表达绵羊已知miRNA分别得到68个,1个和9个靶基因,差异表达novel miRNA分别得到363个,168个和29个靶基因。靶基因的GO和pathway分析表明,2月龄vs 6月龄睾丸差异表达绵羊已知miRNA的靶基因显著富集到细胞凋亡,减数分裂I期,顶体反应等100个生物过程及Hedgehog和Wnt等11条信号通路;6月龄vs 12月龄睾丸差异表达绵羊已知miRNA的靶基因显著富集到多细胞生物生殖,精卵结合,单受精和蛋白水解4个生物过程;2月龄vs 12月龄睾丸差异表达绵羊已知miRNA的靶基因显著富集到腺苷代谢,嘌呤碱基代谢及核苷酸代谢等17个生物过程及核黄素代谢和花生四烯酸代谢等4条信号通路。5.睾丸发育和精子发生关键miRNA及其靶基因筛选验证:构建了3个miRNA-靶基因调控网络,基于GO和KEGG分析,筛选出睾丸发育和精子发生关键oarmiR-379-5p及其候选靶基因WNT8A和oar-miR-665-3p及其候选靶基因CCIN。双荧光素酶报告基因检测系统结果证明了WNT8A是oar-miR-379-5p的靶基因,CCIN可能不是oar-miR-665-3p的靶基因。 【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S826

【图文】：

示意图,睾丸,内部结构,示意图

1.1 睾丸组织学结构睾丸是雄性哺乳动物生殖系统中最重要的器官，存在于阴囊内，呈椭圆形，左右各一，成对存在，分内、外侧面，前、后缘和上、下端。前缘游离，后缘有血管、神经和淋巴管出入，并与附睾和输精管的睾丸部相接触。上端和后缘有附睾头贴附，下端游离。睾丸表面覆有一层浆膜，浆膜下方是坚硬致密结缔组织构成的白膜，浆膜和白膜构成了睾丸的被膜（称为固有鞘膜），白膜沿睾丸后缘增厚，深入睾丸内形成睾丸纵隔，从纵隔发出许多呈放射状排列的结缔组织，将睾丸又分成许多小叶，睾丸小叶内包含盘曲折叠的生精小管（曲细精管）[5]。睾丸主要分为两部分：睾丸间质和曲细精管。睾丸间质由疏松结缔组织、血管和淋巴管、以及多种类型细胞（包括间质细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、粒细胞）组成；曲细精管，每条长约 30~80cm，直径150~250μm，，主要由基膜，管周细胞，支持细胞和各级生精细胞（精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞及精子）组成，是精子发生的场所[6]，睾丸内部结构如图 1.1 所示。

生精小管,睾丸,进程

图 1.2 睾丸生精小管中精子发生的进程Fig. 1.2 The process of spermatogenesis in testicular seminiferous tubules1.2 精子发生哺乳动物精子发生是一个发生在曲细精管中由精原干细胞经过有丝分裂增值分化后再经过一系列的分裂和分化形成精子的高度复杂而精密过程[20]。雄性哺乳动物的睾丸曲细精管生精上皮上从青春期开始直到睾丸生殖机能衰退一直进行着生精细胞的增值分化并不断产生成熟精子。精子发生过程包括染色体复制、基因重组、二倍体细胞通过减数分裂（染色体数目减半）产生单倍体精子细胞以及球形精子细胞分化形成高度压缩的蝌蚪状精子释放到管腔。简而言之，精子发生主要分为三个阶段：(1) 精原细胞增值分化形成初级精母细胞——精原细胞有丝分裂增殖分化阶段；（2）初级精母细胞经历两次连续的减数分裂形成圆形精子细胞——精母细胞减数分裂阶段；（3）圆形精子细胞分化变形为成熟精子释放到管腔后转移至附睾中成熟、储存——精子形成阶段。1.2.1 精原细胞有丝分裂增殖分化阶段

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