应激条件下GRP94调节猪肝脏细胞损伤的机理

发布时间：2020-06-14 02:36

【摘要】：应激条件下葡萄糖调节蛋白94(Glucose-regulated protein 94,GRP94)如何参与肝脏损伤的机制尚不清楚,本论文拟从以下五个方面进行研究:试验一持续高温应激下生长猪GRP94与IGF-1表达规律研究试验选取27头体重相近(40.8±2.7 kg)的大白阉公猪,随机分为3个组:适温对照组(Thermal neutral,TN)、高温应激组(Heat stress,HS)和采食量配对组(Pair-fed thermal neutral,PFTN),试验期21 d。结果发现:与TN组比,HS组肝脏GRP94和胰岛素样生长因子(Insulin like growth factor1,IGF-1)表达显著升高(P0.05),血浆IGF-1:IGFBP-3比值极显著升高(P0.01)。持续高温下GRP94蛋白表达与IGF-1水平呈中等相关,相关系数为0.69。结果表明,HS诱发内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS),并使IGF-1升高,且IGF-1含量与GRP94表达呈中等相关。试验二猪肝脏永生化细胞内质网应激模型构建试验分别采用浓度为1、2、5、10和15μg/mL的衣霉素(Tunicamycin,TM)处理猪肝星状细胞系(Hepatic stellate cell,HSC),培养2、4、8、16、24和36 h。根据检测的细胞抑制率、细胞周期和ERS相关基因和蛋白表达,确定5μg/mL TM处理24 h可成功构建细胞ERS模型。试验三内质网应激条件下GRP94低表达对猪肝细胞损伤、IGF-1表达及泛素化的影响试验构建GRP94基因沉默慢病毒,用其转染猪HSC 72 h后,加入5μg/mL TM继续培养24 h,收集细胞进行检测。结果发现,GRP94低表达在ERS下显著抑制p-IRE1蛋白表达(P0.01)。GRP94低表达在ERS下促进HSC凋亡,显著降低HSC泛素蛋白及IGF-1表达(P0.05)。试验表明,抑制GRP94表达导致细胞损伤,降低IGF-1表达。试验四仔猪内质网应激模型的构建及细胞损伤、泛素化检测试验选取21头35日龄、体重9.34±0.3 kg的杜长大仔公猪,随机分成三组,分别腹腔注射:(1)对照组(DMSO);(2)TM-低剂量(Low dosage,LD;0.1 mg/kg);(3)TM-高剂量(High dosage,HD;0.3 mg/kg)。48 h后屠宰。结果发现:与对照组比,LD和HD组肝脏ERS相关蛋白和基因极显著升高(P0.01),血浆炎症因子和补体因子均显著升高(P0.05),对肝细胞凋亡率及凋亡相关基因蛋白表达未有显著性影响。此外,LD组肝脏泛素蛋白表达显著上调(P=0.04),泛素化相关基因表达也显著升高(P0.05)。结果表明,两种剂量TM均可成功诱导仔猪肝脏ERS,且HD组ERS更为显著。试验五内质网应激下猪肝脏蛋白组学分析及GRP94与IGF-1关系探索试验利用iTRAQ技术分析高剂量TM处理引起的ERS对仔猪肝脏差异表达蛋白的影响。试验共筛选出311个差异表达蛋白。通过生物信息学分析发现差异蛋白主要参与炎症反应和免疫系统调控,富集于代谢、内质网蛋白、补体凝血级联反应等信号通路。GRP94和IGF-1在ERS下表达均显著升高(P0.05),通过String network分析发现GRP94通过PDIA3与IGF-1发生相互作用。综上,体内外应激下,IGF-1随GRP94变化发生正向变化。 【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.28

【图文】：

信号通路,真核细胞,细胞凋亡

业科学院博士学位论文第一章。适度的 UPR 可有效地保护细胞，但如果持续的 ERS 造成未折叠蛋白大量累积，超应的范围，便会触发细胞凋亡(McGuckin et al., 2010)。近期研究提示，UPR 三条信度的激活可能是导致细胞凋亡的关键性因素(Tabas and Ron, 2011; Song et al., 201516; Doultsinos et al., 2017)。在 ERS 长期存在的状况下，IRE1、ATF6 两条通路的活性减弱，而 PERK 信号通路则可持续激活，从而促进细胞凋亡(Lin et al., 2007; Rozped。RS 条件下，UPR 三条信号通路之间彼此相互影响(朱旭, 2014)。IRE1 通过其核酸内P1，是促进应激细胞存活的保护机制之一(Liu et al., 2015)。ATF6参与调控IRE1通路中，并与其形成异构体，进而加快非折叠或错误折叠蛋白的降解，而未剪切的 XBP1的 ATF6 被降解(Yoshida et al., 2001)。此外，IRE1 通路及 ATF6 通路也受到 PERK 的通过调控 miR-424(322)-503 反馈激活 IRE1 和 ATF6(Gupta et al., 2015)。此外，ATF6运也受到 PERK 的影响(Yamamoto et al., 2007)。

泛素化,降解途径,相关蛋白,泛素

科学院博士学位论文第一程：1.将多个泛素分子共价修饰到错误折叠蛋白上；2.蛋白酶系就标记的蛋白其中泛素共价修饰底物蛋白的过程称为细胞的泛素化，是该过程中最为关键的一Ubiquitination，Ub）是将 8.6KD 大小的泛素与靶蛋白连接。泛素化修饰（Ubiqation，UM）主要分为两种，一种是与赖氨酸残基相连，形成多聚泛素链，另一末端的蛋氨酸形成线性多聚泛素链。泛素化修饰过程是由三种限速酶催化的级联素活化酶、E2 泛素结合酶和 E3 泛素连接酶（见图 1.2）。有研究发现，增强 ERS 下的错误折叠蛋白，可以显著降低 ERS 诱导的细胞凋亡 (Cybulsky, 2012)。此胞中增强泛素连接酶的活性，可减少细胞遭受的内质网应激(王花枝 et al., 201细胞通过将 Bcl-xL 泛素化修饰促使其降解，进而导致细胞凋亡(Wu et al., 2018过将部分关键蛋白泛素化影响后续的代谢等功能，研究发现肝细胞在 ERS 下可以调节脂质代谢(刘佳, 2015)。另有文献发现，细胞处于强烈的 ERS 下导致细胞激活，是由于 E3 连接酶 CHIP 泛素化激活 IRE1，，形成 IRE1/TRAF2/ASK1 复胞凋亡(施伟梅 et al., 2018)。

【相似文献】