克隆牛妊娠异常母体黄体miRNA的筛选及鉴定

发布时间：2020-06-14 13:40

【摘要】：MiRNA是一类非编码内源性转录后调控小RNA,通过作用于靶基因的3′-UTR,抑制靶基因翻译或者直接导致其降解,以达到对靶基因的调控目的。据统计,miRNA能够调控人基因组近1/3的蛋白编码mRNA,因此,miRNA的挖掘、鉴定和功能验证是当前分子生物学领域的研究热点。体细胞克隆技术是指将动物的的体细胞核移入去核卵母细胞中,构成重组胚,并最终发育成完整个体的技术。克隆牛的早期妊娠率较高,但随着妊娠延续流产和异常妊娠(腹围偏大)时有发生,致使克隆效率较低。本实验旨在利用高通量测序技术,分析异常妊娠体细胞克隆牛和正常妊娠牛母体黄体组织中差异表达的miRNA,筛选并验证表达差异显著的mi RNA,分析得到与妊娠维持相关的候选靶基因,并初步建立与妊娠维持相关的靶基因和miRNA相互作用的调控网络,进而了解妊娠异常的分子调控机制。本研究采集2头180d妊娠异常克隆牛为实验组,3头180d正常妊娠牛为对照组,分别采集其黄体组织。利用Illumina测序平台,鉴定出2069个miRNAs,1759个miRNAs差异表达,其中11个显著上调,22个显著下调。利用SOAP靶基因分析软件预测出5746个靶基因,得出miRNA靶基因富集显著的KEGG通路和GO信号通路。分析发现hsa-mi R-874-5p、hsa-miR-152-5p、bta-miR-495、PC-5p-35049_13、PC-3p-41396_10与Bax,Caspase-9,TP53,AIF,Caspase-3,Cyto c,Apaf-1,ING2靶基因相互作用,通过调控黄体内的细胞凋亡途径,导致激素分泌水平异常,进而影响母牛妊娠的维持。选取表达量较高的9个表达差异显著的miRNA,利用荧光定量PCR对其在体细胞克隆组与正常妊娠组中的表达水平进行验证,结果显示6个与测序结果一致,3个测序不一致。选取细胞凋亡通路中的11个相关基因,利用荧光定量PCR检测其表达量变化,初步确认了黄体组织中细胞凋亡途径在控制母牛妊娠时的作用机制。本研究发现,实验组与对照组中存在着大量差异表达的miRNA,这些异常表达的miRNA与实验组妊娠异常有关。进一步对相关靶基因表达水平的鉴定发现,一些miRNA对黄体中细胞凋亡通路有一定的调控作用,为后续miRNA的功能验证和黄体中参与妊娠维持的调控机制的探索奠定了基础。
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S814.8
【图文】：

机制,靶基因

图 1 miRNA 的形成机制[57]Fig1.The formation mechanism of miRNA..3 miRNA 的作用机制miRNA 的形成及其对靶基因的作用机制是一个很诱杂的生理过程（图 2）。起成熟的 miRNA 都是以双反互补的形反存在，形成一种双螺旋结构。接下来，双旋的螺旋打开，其中的一条会结诱到 RNA 细导的基因诱诱诱诱物中NA—induced silencing complex，RISC），进而形成一种 RISC 诱诱物，该诱诱物和目标基因相结诱。对动物而言，研究发现 miRNA 多与靶基因 3’UTR 发生不完对，从而达到抑制靶基因表达的目的。对体物而言，miRNA 不仅能与靶基因TR 不完全配对，还能与靶基因的开开开开开开（ORF）完全配对，对相关靶基因剪切，从而使靶基因降解，以达到调控基因表达的作用[58]。

途径,黄体,靶基因

图 2 miRNA 的作用途径Fig 2 The role of miRNARNA 在动物发育调控中的作用测，每一个 miRNA 似乎都有可能调控着大量的靶基因[59-66]。因此种生物学功能，并调控着广谱的蛋白编码基因。这表明 miRNA了一种转录后水平基因调控的基本模反，该模反可能存在于所有此，在黄体组织中同样存在大量的可调控靶基因表达的 miRNAka 等报道 Dicer1d/d 小鼠黄体组织中血管的数目和长度显p 和 let-7p 调节免血管生成因子 Timp1 的表达，维持黄体组织的血浆孕孕水平[67]。Hossain 等分析了 9 个已知和 38 个未知的牛源织和卵巢细胞中的表达量，结果表明成熟黄体高表达的 microRN达或低表达，证实了在牛的黄体中存在特异表达的 microRNA利用实时荧光定量 PCR 技术检测了 miR-147、miR-148b、miR-30 在牛功能黄体和退化黄体中的表达量变化[69]。徐靖博等利用实

【参考文献】