硫氧还蛋白（Trx）在鸡心肌细胞损伤中的作用及机制研究

发布时间：2020-06-14 16:03

【摘要】：硫氧还蛋白(Trx)是一种广泛存在于不同生物体内的小分子蛋白,它在机体内发挥重要的抗氧化功能已被证明,我们课题组在前期的研究中发现,缺硒会引起鸡心肌细胞发生损伤,又可以导致鸡心肌细胞内Trx的表达降低,因此我们猜测Trx与鸡的心肌细胞损伤之间可能存在某种关系,但其具体的作用及机制尚不明确。因此,为了研究Trx在鸡心肌细胞损伤中的作用及机制,我们在建立鸡心肌细胞Trx基因敲低模型的基础上,应用RNA干扰技术、免疫印迹法、实时定量PCR等方法,对心肌细胞中硒蛋白、心肌细胞能量代谢水平、Akt磷酸化水平、热休克蛋白(HSPs)、内质网应激、钙离子水平及钙离子通道、自噬和凋亡、炎症、细胞因子等基因丰度及含量进行检测,探讨Trx在鸡心肌细胞损伤中的作用及机制,为更好更全面的了解Trx功能及作用提供重要证据。试验结果如下:(1)Trx基因敲低可引起鸡心肌细胞中能量代谢相关基因的变化,其中IGF1、IGF2、IGFBP2、IGFBP4、IR、IRS1、IRS2、GLUT1、GLUT3、GLUT8 mRNA水平和蛋白水平显著降低,IGFBP3 mRNA和蛋白水平显著升高,PI3K、AKT、P-PI3K mRNA水平和蛋白水平显著降低,FOX、P-FOX、JNK mRNA水平和蛋白水平显著升高,表明Trx基因敲低可以通过抑制PI3K/AKT通路引起心肌细胞中能量代谢的紊乱。(2)Trx基因敲低可以使心肌细胞中钙离子含量发生显著升高,引起鸡心肌细胞中NCX、PMCA、CALM mRNA水平显著降低,SERCA、STIM1、CACNA1S、TRPC1、TRPC3、Orail、TRP1、TRP2、TRP3、RyR1、RyR2、RyR3 mRNA水平显著升高。同时,SERCA的蛋白水平也发生了显著升高,NCX、PMCA、CALM的蛋白发生了显著降低。表明Trx基因敲低可引起鸡心肌细胞中钙离子超载。(3)通过电子显微镜观察,在Trx敲低组心肌细胞中发现明显的自噬小体,提示Trx敲低可以引起鸡心肌细胞发生自噬,从而造成心肌细胞发生损伤。同时我们通过检测与自噬-凋亡相关基因的表达丰度时发现,Trx基因敲低可引起鸡心肌细胞中自噬相关基因mTOR mRNA水平显著降低了,Becline-1、LC3-1、LC3-2、Dynein、SQSTM、ATG3、ATG5、ATG9、ATG12 mRNA水平则显著升高,同时,LC3-1、LC3-2、mTOR的蛋白水平也显著降低,Becline-1蛋白水平显著升高。表明Trx基因敲低使鸡心肌细胞发生了明显的自噬现象。Trx基因敲低可引起鸡心肌细胞中凋亡相关基因Bax、Caspase-3、Fas mRNA水平显著降低,Caspase-6、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9 mRNA水平显著升高。同时,Bax、Caspase-3的蛋白水平也发生了显著降低,Bcl-2的蛋白水平显著升高。表明Trx基因敲低启动了鸡心肌细胞中凋亡通路,但是由于Caspase-3基因的抑制,我们认为这种凋亡反应不是引起心肌细胞损伤的主要原因,我们将其视为机体的一种前期保护机制。(4)Trx基因敲低可显著引起鸡心肌细胞中热休克相关蛋白的变化,其中HSP40 mRNA水平显著降低,HSP27、HSP60、HSP70以及HSP90 mRNA水平显著升高。表明Trx基因敲低可引起鸡心肌细胞发生热休克反应,以此对抗不良条件下造成的细胞死亡。(5)Trx基因敲低可引起鸡心肌细胞中内质网应激激活的信号通路中XBP1、GRP78、GRP94、IRE、ATF4、ATF、EIF2αmRNA水平显著升高,同时,GRP78、XBP1、ATF4、ATF6的蛋白水平也显著升高。表明Trx基因敲低可通过ATF6通路途径引起鸡心肌细胞发生强烈的内质网应激。(6)Trx基因敲低可引起鸡心肌细胞中与心肌细胞收缩功能相关的TNT,TNC mRNA和蛋白水平显著降低,MYL2,MYL3 mRNA和蛋白水平显著升高。表明Trx基因敲低使得鸡心肌细胞收缩受到影响。(7)Trx基因敲低可引起鸡心肌细胞中炎症和免疫相关基因的变化,其中IL-7,IL-17mRNA水平显著降低,而iNOS、NF-κB、COX-2、TNF-α、PTGEs、HO-1、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10 mRNA水平显著升高,同时,COX-2、HO-1、iNOS、NF-κB的蛋白水平也显著升高。表明Trx基因敲低使鸡心肌细胞发生了显著的炎症反应,而且某些相应的细胞因子也发生变化,从而调控机体其他代谢反应。(8)Trx基因敲低可引起鸡心肌细胞中25种不同硒蛋白的变化,其中Dio1、Dio2、Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、TrxR1、TrxR2、TrxR3、Selt、Selw、Selk以及Sepx1水平显著降低,而Dio3、Selm、Selp15、Selh、Selu、Seli、Seln、Sepp1、Selo、Sels、Sels2和Selp水平显著升高,证实了Trx基因敲低可引起鸡心肌细胞中硒蛋白表达含量的变化。综上所述,Trx敲低可以通过抑制PI3K/AKT通路使鸡心肌细胞胰岛素代谢发生紊乱,能量代谢的紊乱进一步可以诱发心肌细胞细胞质中Ca~(2+)超载,继而引起内质网应激的发生,此外心肌细胞也发生了强烈的自噬反应并伴有炎症的发生,而在整个损伤过程中,热休克蛋白发挥重要的保护功能。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.31
【图文】：

心肌细胞,自噬,鸡心,肌细胞

3.7 鸡心肌细胞中自噬-凋亡变化的检测结果3.7.1 电子显微镜观察鸡心肌细胞自噬-凋亡的变化结果如图3-13所示，利用电子显微镜观察，发现在Trx敲低组心肌细胞中发现明显的自噬小体，以及细胞核溶解等变化。

【参考文献】